Selection and weighting change the interpretation of phagocyte uptake and optical imaging

Per capire come il corpo pulisce i propri scarti, gli scienziati osservano spesso le cellule immunitarie chiamate macrofagi. Queste cellule agiscono come aspirapolvere microscopici, cercando detriti, cellule morte o batteri invasori, inghiottendoli e decomponendoli. Per vedere ciò che accade, i ricercatori utilizzano potenti microscopi in grado di tracciare le cellule e i tag luminosi attaccati ai rifiuti che esse mangiano. Contando quante cellule stanno mangiando e misurando la luminosità o la tempistica della luce proveniente da esse, gli scienziati sperano di capire quanto bene funzioni il sistema immunitario. Tuttavia, il modo in cui queste immagini vengono raccolte e le regole specifiche utilizzate per contarle possono cambiare silenziosamente la storia che i dati raccontano. Se un ricercatore decide di osservare un gruppo di cellule leggermente diverso o pesa i punti luminosi in un'immagine in modo differente, la conclusione finale sull'attività del sistema immunitario può cambiare drasticamente, anche se le immagini grezze non sono cambiate.

Uno studio recente di Elkin Navarro Quiroz presso l'Universidad Simón Bolívar in Colombia indaga esattamente come queste scelte modellino la nostra comprensione del comportamento delle cellule immunitarie. Il ricercatore non ha eseguito nuovi esperimenti né ha osservato nuove cellule. Al contrario, ha preso tre set di dati pubblici esistenti — record del conteggio dei macrofagi, immagini grezze di segnali luminosi e filmati di cellule immunitarie in pesci — e li ha rianalizzati utilizzando regole diverse. L'obiettivo era vedere se cambiare i criteri di selezione o il modo in cui i segnali vengono pesati potesse invertire le conclusioni che gli scienziati traggono dalle stesse osservazioni. I risultati mostrano che la risposta dipende interamente da come i dati vengono gestiti, e che i modi standard di riassumere queste immagini possono nascondere dettagli importanti o creare tendenze fuorvianti.

Lo studio è iniziato osservando come gli scienziati contano quanti macrofagi partecipano all'alimentazione. In un set di dati, i ricercatori avevano registrato quanti cellulari erano visibili e quanti di essi erano etichettati come "in fase di alimentazione" in momenti diversi. Quando l'autore ha applicato una regola — contando qualsiasi cellula che fosse visibile in un momento specifico — la percentuale di cellule che sembravano mangiare è salita da circa il 24 percento al 37 percento. Ma quando è stata applicata una regola più rigorosa, che richiedeva che una cellula fosse visibile ed eleggibile per l'intera durata dell'esperimento, la percentuale è scesa dal quasi 47 percento al 37 percento. Entrambi i calcoli partivano dallo stesso numero di cellule che mangiavano, ma il numero totale di cellule considerate era cambiato. Questo semplice spostamento del denominatore, o del gruppo totale oggetto di misurazione, ha ribaltato la direzione del confronto tra due diverse condizioni sperimentali. Ciò che sembrava un aumento dell'attività sotto una regola appariva come una diminuzione sotto un'altra. Lo studio evidenzia che senza dichiarare chiaramente quali cellule fossero incluse nel conteggio finale, è impossibile sapere se il sistema immunitario stia diventando realmente più attivo o se il cambiamento sia solo un artefatto del metodo di conteggio.

La ricerca si è poi rivolta ai segnali luminosi stessi, utilizzando una tecnica chiamata imaging della fluorescenza a tempo di vita (fluorescence lifetime imaging). Questo metodo misura il minuscolo ritardo tra quando una cellula viene colpita da un impulso di luce e quando emette luce in risposta. Questo ritardo, misurato in nanosecondi, può indicare agli scienziati l'ambiente chimico all'interno della cellula. L'autore ha preso due immagini grezze di macrofagi e si è chiesto cosa sarebbe successo se avesse guardato solo le parti più luminose dell'immagine. Quando ha selezionato solo i pixel con la luce maggiore, il tempo medio di arrivo dei fotoni è anticipato di 0,135 nanosecondi in un'immagine e di 0,099 nanosecondi nell'altra. Per testare se questo fosse un effetto reale o solo rumore casuale, ha creato una simulazione al computer che manteneva lo stesso numero di particelle di luce ma ne rimescolava le posizioni. In quella simulazione, lo spostamento era minimo, quasi nullo. Il fatto che lo spostamento reale fosse molto maggiore di quello simulato ha dimostrato che le aree più luminose dell'immagine erano genuinamente associate a tempi di arrivo più precoci. Ciò significa che se uno scienziato sceglie di concentrarsi solo sui punti più luminosi, non sta solo vedendo più luce; sta vedendo un segnale temporale completamente diverso. Lo studio sottolinea che il modo in cui la luce viene pesata — se ogni particella conta ugualmente o se i punti luminosi contano di più — cambia fondamentalmente il numero riassuntivo riportato.

Infine, l'articolo ha esaminato come viene gestito il tempo nei filmati delle cellule immunitarie. Il ricercatore ha esaminato tre filmati di microglia, un tipo di cellula immunitaria nel cervello, e ha misurato quanto l'immagine cambiasse da un fotogramma all'altro. Ha scoperto che anche rimescolando l'ordine dei fotogrammi, distruggendo completamente la cronologia degli eventi, la classifica dei filmati dal "più attivo" al "meno attivo" rimaneva esattamente la stessa. Il filmato che appariva il più attivo nell'ordine originale rimaneva il più attivo anche quando i fotogrammi venivano mescolati. Ciò accadeva perché la quantità complessiva di differenza visiva tra due fotogrammi qualsiasi in quel filmato era naturalmente più alta rispetto agli altri. Sebbene la classifica sia sopravvissuta al caos, la misura effettiva del cambiamento nel tempo non lo era. La variazione accumulata, che descrive quanto l'immagine cambi passo dopo passo, è diminuita significamente quando l'ordine è stato interrotto. Questo rivela che una classifica stabile non garantisce che i dati preservino la vera storia di ciò che è accaduto nel tempo. Un riepilogo può apparire coerente anche quando le relazioni temporali che definiscono il processo biologico sono scomparse.

Il messaggio globale di questo lavoro è che l'interpretazione dell'imaging biologico è fragile. Lo studio non sostiene di aver trovato un nuovo modo per misurare la salute immunitaria o un nuovo marcatore per le malattie. Al contrario, funge da controllo rigoroso su come i dati vengono attualmente utilizzati. Dimostra che la scelta di quali cellule includere, di come pesare i segnali luminosi e di come gestire il tempo può alterare la conclusione tanto quanto l'evento biologico stesso. Quando i ricercatori riferiscono che un gruppo di cellule sta mangiando di più di un altro, o che è presente un certo stato chimico, devono anche riferire le regole specifiche che hanno utilizzato per arrivarci. Senza questi dettagli, i numeri sono soggetti a molteplici, talvolta contraddittorie, narrazioni. Lo studio conclude che affinché la scienza possa progredire, i metodi di selezione e ponderazione devono essere resi espliciti, assicurando che i numeri riassuntivi riflettano davvero la realtà biologica che intendono descrivere.