CRISPRi loss-of-function mutations revealed through experimental evolution in Burkholderia cenocepacia
Attraverso l'evoluzione sperimentale di mutanti CRISPRi di *Burkholderia cenocepacia*, i ricercatori hanno identificato che la reversione fenotipica alla crescita del tipo selvatico è stata causata da difetti nell'assorbimento del ramnosio che hanno portato alla perdita dell'espressione di dCas9, piuttosto che da mutazioni nel meccanismo CRISPRi stesso.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Immaginate i batteri come piccole, frenetiche fabbriche che non smettono mai di lavorare. All'interno di ogni fabbrica, ci sono certe macchine così critiche che, se si rompono, l'intera operazione si interrompe per sempre. Gli scienziati le chiamano "geni essenziali". Per molto tempo, studiare queste macchine è stato come cercare di smontare un motore in funzione per vedere come funziona; se rimuovevi una parte critica, il motore si fermava e non potevi imparare nulla su di esso. Per risolvere questo problema, gli scienziati hanno inventato un trucco astuto chiamato CRISPRi (interferenza CRISPR). Pensate a CRISPRi non come a un paio di forbici che taglia il motore, ma come a un gigantesco "tasto muto" programmabile. Quando gli scienziati premono l'interruttore, questo tasto muto si aggancia al gene essenziale, rallentandolo quanto basta per vedere cosa succede senza uccidere la fabbrica. Ciò permette ai ricercatori di studiare come funzionano queste parti vitali e persino di dare la caccia a nuovi modi per impedire ai cattivi batteri di crescere. Tuttavia, proprio come un operaio di fabbrica potrebbe cercare di aggirare un blocco di sicurezza per far continuare a lavorare le macchine, i batteri sono incredibilmente bravi a trovare modi per superare in astuzia questi trucchi genetici.
Questo articolo racconta la storia di un team di scienziati che ha cercato di usare questo sistema a "tasto muto" su un tipo specifico di batterio chiamato Burkholderia cenocepacia, un germe che può causare problemi alle persone con fibrosi cistica. Hanno allestito un esperimento in cui costringevano i batteri a crescere mentre i loro geni essenziali venivano silenziati. Volevano vedere se i batteri sarebbero riusciti a tenere il passo di questa danza al rallentatore o se avrebbero finito per liberarsi. Ciò che hanno scoperto è stato un affascinante gioco di inseguimenti tra il gatto e il topo evolutivo. I batteri non avevano rotto il tasto muto in sé, né avevano rotto il gene che dovevano silenziare. Invece, avevano trovato un modo per fermare l'interruttore che accendeva il tasto muto all'origine.
I ricercatori sono partiti con 15 diversi ceppi batterici, ciascuno con un diverso gene essenziale silenziato. Hanno osservato la loro crescita per 24 ore, aggiungendo uno zucchero speciale, il ramnosio, per attivare il tasto muto. All'inizio, i batteri faticavano, crescendo molto più lentamente del solito. Ma mentre gli scienziati passavano i batteri a nuovi piatti (come spostarli in nuovi parchi giochi) per tre round, accadde qualcosa di interessante. I batteri iniziarono a recuperare la loro crescita normale e veloce. Era come se gli operai della fabbrica avessero capito come ignorare il segnale di "muto".
Per capire come ci fossero riusciti, il team ha esaminato da vicino il DNA dei batteri e la loro macchina interna. Avevano il sospetto che forse i batteri avessero mutato il tasto muto (la proteina dCas9) o le istruzioni per l'RNA guida. Ma quando hanno controllato, il tasto muto e le istruzioni erano perfettamente intatti. Il vero colpevole era qualcosa di più sottile. I batteri avevano smesso di produrre completamente la proteina del tasto muto. Non era che le istruzioni fossero rotte; era che la fabbrica aveva smesso di accendere le luci nella stanza dove il tasto muto veniva prodotto.
Gli scienziati hanno scoperto che il sistema del tasto muto si affida al fatto che i batteri mangino uno zucchero specifico, il ramnosio, per sapere quando attivarsi. In uno dei batteri evoluti, hanno trovato piccoli cambiamenti nei geni responsabili di un camioncino per la consegna dello zucchero (un trasportatore di zucchero ABC). Sembra che i batteri avessero rotto i propri camioncini per la consegna, così il ramnosio non entrava mai all'interno della cella. Senza lo zucchero, l'interruttore non scattava, il tasto muto non si attivava e i geni essenziali ricominciavano a lavorare a pieno regime. Questo suggerisce che i batteri non abbiano combattuto direttamente contro il tasto muto; hanno semplicemente smesso di alimentare il sistema che lo attivava.
Lo studio ha anche esaminato come diversi tipi di batteri reagissero. Alcuni si sono ripresi molto velocemente, altri hanno impiegato più tempo, formando tre gruppi distinti in base a come crescevano. Interessantemente, in un caso, i batteri hanno perso la proteina del tasto muto ma il gene era ancora silenziato, un mistero che suggerisce che possa esserci più di un modo in cui i batteri possono sfuggire al sistema. I ricercatori concludono che, sebbene il CRISPRi sia uno strumento potente per studi a breve termine, i batteri sono incredibilmente adattabili. Se si cerca di silenziare i geni essenziali per troppo tempo, i batteri probabilmente troveranno un modo per tagliare l'alimentazione al vostro sistema di controllo piuttosto che rompere il sistema stesso. Questo non significa che lo strumento sia inutile, ma suggerisce che, per un controllo a lungo termine, gli scienziati potrebbero dover garantire che i batteri non possano facilmente nascondersi dall'interruttore che attiva il sistema.
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