The effect of Niosomes-Loaded Rapamycin against Leishmania major: An in vitro and in vivo study

Sintesi Tecnica: L'effetto dei niosomi carichi di rapamicina contro Leishmania major: uno studio in vitro e in vivo

Problematica
La leishmaniosi cutanea (LC), causata dai parassiti Leishmania, rimane una sfida significativa per la salute pubblica con opzioni terapeutiche limitate. Gli attuali trattamenti di prima linea, come gli antimoniali pentavalenti (ad es. Glucantime), sono associati a una grave tossicità, alla necessità di somministrazione parenterale dolorosa e a una crescente resistenza ai farmaci. Sebbene le formulazioni topiche offrano una via per evitare la tossicità sistemica, esse spesso falliscono a causa della scarsa penetrazione del farmaco attraverso lo strato corneo e di un'inadeguata ritenzione all'interno dei macrofagi dermici, le principali cellule ospiti del parassita. Inoltre, è stata rilevata la potenziale capacità immunomodulatoria della rapamicina (un inibitore di mTOR) nel deviare la risposta dell'ospite verso un fenotipo Th1 protettivo, ma la sua applicazione clinica è ostacolata dalla scarsa solubilità acquosa e dalla bassa biodisponibilità. Questo studio affronta la necessità di un sistema di somministrazione topica stabile ed efficace, capace di colpire gli amastigoti intracellulari di Leishmania major sfruttando al contempo le proprietà immunomodulatrici della rapamicina.

Metodologia
Lo studio ha impiegato un approccio completo che ha coinvolto lo sviluppo della formulazione, la caratterizzazione fisico-chimica e la valutazione biologica:

• Formulazione: I niosomi carichi di rapamicina sono stati preparati utilizzando il metodo dell'iniezione di etanolo. La formulazione consisteva in rapamicina, colesterolo, Polysorbate 80 (tensioattivo idrofilo) e Span 20 (tensioattivo lipofilo). La fase organica è stata iniettata in una fase acquosa riscaldata (60°C) per indurre l'auto-assemblaggio.
• Caratterizzazione: I niosomi risultanti sono stati analizzati per dimensione delle particelle, indice di polidispersità (PDI), potenziale zeta e morfologia (tramite TEM). L'efficienza di incapsulamento (EE%) è stata determinata tramite HPLC dopo ultracentrifugazione. La stabilità fisica è stata valutata per 90 giorni a temperature refrigerate (4–8°C) e a temperatura ambiente.
• Saggi In Vitro:
  • Suscettibilità dei Promastigoti: I promastigoti di L. major sono stati trattati con rapamicina libera, rapamicina niosomale e Glucantime. L'attività metabolica è stata misurata tramite densità ottica (OD) a 540 nm dopo 72 ore per determinare i valori di IC₅₀.
  • Suscettibilità degli Amastigoti: Macrofagi peritonei murini sono stati infettati con promastigoti in fase stazionaria. Le cellule infette sono state trattate con le formulazioni di test per 72 ore. Il carico di amastigoti è stato quantificato contando i parassiti in vetrini colorati con Giemsa.
• Studio In Vivo: È stato stabilito un modello murino utilizzando topi femmine BALB/c mediante inoculazione sottocutanea di L. major nel terzo posteriore destro. Dopo 4 settimane di infezione, i topi sono stati divisi in quattro gruppi (n=5):
  1. Gel topico di niosomi carichi di rapamicina.
  2. Gel di rapamicina libera topica.
  3. Gel di niosomi vuoti (controllo del veicolo).
  4. Glucantime intraperitoneale (controllo positivo).
     Lo dimensione della lesione (spessore del polpaccio) è stata misurata settimanalmente per 28 giorni.

Contributi Chiave e Risultati

• Proprietà Fisico-Chimiche: La formulazione niosomale è stata ottimizzata con successo, producendo vescicole bilayer sferiche con una dimensione media delle particelle di circa 220 nm, un basso PDI (<0,3) e un'efficienza di incapsulamento eccezionalmente alta (≥99,99%). La formulazione ha dimostrato una robusta stabilità fisica per 90 giorni senza cambiamenti significativi in termini di dimensioni, separazione di fase o cristallizzazione del farmaco.
• Efficacia In Vitro:
  • Amastigoti: Sia la rapamicina libera che quella niosomale hanno mostrato un'attività significativa contro gli amastigoti intracellulari. In particolare, la formulazione niosomale ha mostrato un'efficacia paragonabile al farmaco standard Glucantime, con valori di IC₅₀ intorno a 14–15 µg/mL.
  • Promastigoti: Il Glucantime ha dimostrato una potenza significativamente maggiore contro i promastigoti extracellulari rispetto alle formulazioni di rapamicina. Sebbene la rapamicina niosomale abbia mostrato un leggero miglioramento numerico rispetto alla rapamicina libera, la differenza non è stata statisticamente significativa.
• Efficacia In Vivo: Nonostante i promettenti risultati in vitro, l'applicazione topica dei niosomi carichi di rapamicina non ha ridotto la dimensione della lesione nel modello murino. Non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa nella progressione della lesione tra il gruppo di rapamicina niosomale, il gruppo di rapamicina libera e il gruppo di controllo non trattato durante il periodo di trattamento di 4 settimane. Al contrario, la somministrazione intraperitoneale di Glucantime ha portato a una riduzione costante e significativa della dimensione della lesione.

Significatività e Rivendicazioni
L'articolo sostiene che, sebbene la formulazione niosomale abbia raggiunto con successo proprietà fisico-chimiche ottimizzate e dimostrato una potente attività in vitro contro lo stadio patogeno degli amastigoti (comparabile al Glucantime), questa efficacia non si è tradotta in successo terapeutico in vivo tramite la via topica.

Lo studio evidenzia una discrepanza critica tra la potenza in vitro e l'esito in vivo. Gli autori concludono che il fallimento della formulazione topica è probabilmente dovuto a una penetrazione insufficiente del farmaco nei tessuti dermici profondi o a una concentrazione inadeguata del farmaco nel sito di infezione per esercitare un effetto terapeutico o immunomodulatorio. I risultati sottolineano che per l'infezione da Leishmania major, la somministrazione sistemica (come dimostrato dal Glucantime IP) rimane il gold standard, e le terapie topiche affrontano sfide sostanziali nel consegnare concentrazioni di farmaco sufficienti per combattere i parassiti intracellulari profondamente radicati. L'articolo suggerisce che il lavoro futuro debba concentrarsi sul potenziamento delle strategie di penetrazione del farmaco o sull'esplorazione della somministrazione sistemica della rapamicina niosomale piuttosto che affidarsi esclusivamente all'applicazione topica per questa specifica formulazione.