The effect of Niosomes-Loaded Rapamycin against Leishmania major: An in vitro and in vivo study

Resumen Técnico: El efecto de los niosomas cargados con rapamicina contra Leishmania major: Un estudio in vitro e in vivo

Planteamiento del problema
La leishmaniasis cutánea (LC), causada por parásitos de la especie Leishmania, sigue siendo un desafío de salud pública significativo con opciones terapéuticas limitadas. Los tratamientos de primera línea actuales, como los antimoniales pentavalentes (por ejemplo, Glucantime), están asociados con una toxicidad severa, la necesidad de administración parenteral dolorosa y una resistencia emergente a los fármacos. Si bien las formulaciones tópicas ofrecen una vía para evitar la toxicidad sistémica, a menudo fallan debido a la pobre penetración del fármaco a través del estrato córneo y una retención inadecuada dentro de los macrófagos dérmicos, que son las principales células huéspedes del parásito. Además, se ha observado el potencial inmunomodulador de la rapamicina (un inhibidor de mTOR) para desplazar la respuesta del huésped hacia un fenotipo Th1 protector, pero su aplicación clínica se ve obstaculizada por su baja solubilidad acuosa y su baja biodisponibilidad. Este estudio aborda la necesidad de un sistema de entrega tópica estable y eficaz capaz de dirigirse a los amastigotes intracelulares de Leishmania major mientras aprovecha las propiedades inmunomoduladoras de la rapamicina.

Metodología
El estudio empleó un enfoque integral que involucró el desarrollo de la formulación, la caracterización fisicoquímica y la evaluación biológica:

• Formulación: Se prepararon niosomas cargados con rapamicina utilizando el método de inyección de etanol. La formulación consistió en rapamicina, colesterol, Polisorbato 80 (surfactante hidrofílico) y Span 20 (surfactante lipofílico). La fase orgánica se inyectó en una fase acuosa calentada (60 °C) para inducir el autoensamblaje.
• Caracterización: Los niosomas resultantes fueron analizados para determinar el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad (PDI), el potencial zeta y la morfología (vía TEM). La eficiencia de encapsulación (EE%) se determinó mediante HPLC tras ultracentrifugación. La estabilidad física se evaluó durante 90 días a temperaturas de refrigeración (4–8 °C) y temperatura ambiente.
• Ensayos in vitro:
  • Susceptibilidad de los promastigotes: Los promastigotes de L. major fueron tratados con rapamicina libre, rapamicina niosomal y Glucantime. La actividad metabólica se midió mediante la densidad óptica (OD) a 540 nm después de 72 horas para determinar los valores de IC₅₀.
  • Susceptibilidad de los amastigotes: Macrófagos peritoneales murinos fueron infectados con promastigotes en fase estacionaria. Las células infectadas fueron tratadas con las formulaciones de prueba durante 72 horas. La carga de amastigotes se cuantificó mediante el conteo de parásitos en láminas teñidas con Giemsa.
• Estudio in vivo: Se estableció un modelo murino utilizando ratones BALB/c hembra mediante la inoculación subcutánea de L. major en el almohadilla plantar posterior derecha. Tras 4 semanas de infección, los ratones se dividieron en cuatro grupos (n=5):
  1. Gel de niosomas cargados con rapamicina por vía tópica.
  2. Gel de rapamicina libre por vía tópica.
  3. Gel de niosomas vacíos (control de vehículo).
  4. Glucantime por vía intraperitoneal (control positivo).
     El tamaño de la lesión (espesor de la almohadilla plantar) se midió semanalmente durante 28 días.

Contribuciones clave y resultados

• Propiedades fisicoquímicas: La formulación niosomal se optimizó con éxito, produciendo vesículas de bicapa esféricas con un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 220 nm, un PDI bajo (<0.3) y una eficiencia de encapsulación excepcionalmente alta (≥99.99%). La formulación demostró una robusta estabilidad física durante 90 días sin cambios significativos en el tamaño, separación de fases o cristalización del fármaco.
• Eficacia in vitro:
  • Amastigotes: Tanto la rapamicina libre como la niosomal exhibieron una actividad significativa contra los amastigotes intracelulares. Notablemente, la formulación niosomal mostró una eficacia comparable al fármaco estándar Glucantime, con valores de IC₅₀ alrededor de 14–15 µg/mL.
  • Promastigotes: El Glucantime demostró una potencia significativamente mayor contra los promastigotes extracelulares en comparación con las formulaciones de rapamicina. Aunque la rapamicina niosomal mostró una ligera mejora numérica sobre la rapamicina libre, la diferencia no fue estadísticamente significativa.
• Eficacia in vivo: A pesar de los prometedores resultados in vitro, la aplicación tópica de los niosomas cargados con rapamicina no logró reducir el tamaño de la lesión en el modelo murino. No hubo una diferencia estadísticamente significativa en la progresión de la lesión entre el grupo de rapamicina niosomal, el grupo de rapamicina libre y el grupo de control no tratado durante el período de tratamiento de 4 semanas. En contraste, la administración intraperitoneal de Glucantime resultó en una reducción constante y significativa del tamaño de la lesión.

Significado y Reivindicaciones
El artículo sostiene que, si bien la formulación niosomal logró alcanzar propiedades fisicoquímicas optimizadas y demostró una potente actividad in vitro contra la etapa patogénica del amastigote (comparable al Glucantime), esta eficacia no se tradujo en un éxito terapéutico in vivo a través de la vía tópica.

El estudio destaca una disparidad crítica entre la potencia in vitro y el resultado in vivo. Los autores concluyen que el fracaso de la formulación tópica se debe probablemente a una penetración insuficiente del fármaco en el tejido dérmico profundo o a una concentración de fármaco inadecuada en el sitio de la infección para ejercer un efecto terapéutico o inmunomodulador. Los resultados subrayan que para la infección por Leishmania major, la administración sistémica (como demostró el Glucantime por vía IP) sigue siendo el estándar de oro, y que las terapias tópicas enfrentan desafíos sustanciales para entregar concentraciones de fármaco suficientes para combatir parásitos intracelulares profundamente asentados. El artículo sugiere que el trabajo futuro debe centrarse en mejorar las estrategias de penetración del fármaco o explorar la administración sistémica de la rapamicina niosomal en lugar de depender únicamente de la aplicación tópica para esta formulación específica.