Image Analysis Tools for Continuous Label-free Quantification of Proliferation and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

Nel mondo della biologia moderna, gli scienziati cercano costantemente di capire come le cellule crescano e cambino. Due dei processi più importanti che studiano sono la proliferazione, ovvero il modo in cui le cellule si moltiplicano per aumentare il loro numero, e la differenziazione, in cui una cellula generica si trasforma in una specializzata, come ad esempio una cellula adiposa. Per decenni, i ricercatori si sono affidati a metodi che richiedono di interrompere l'esperimento, uccidere le cellule e colorarle con coloranti colorati per vedere cosa sta accadendo. Sebbene questi metodi forniscano un'istantanea, sono distruttivi; una volta osservate le cellule, non è più possibile osservarle di nuovo. Ciò rende difficile comprendere la storia fluida e continua di come una popolazione cellulare si evolva nel tempo. Inoltre, le sostanze chimiche utilizzate per rendere visibili le cellule possono talvolta danneggiarle o creare segnali falsi, portando a conteggi imprecisi.

Un campo di ricerca in crescita si sta ora rivolgendo a un approccio diverso: osservare le cellule senza toccarle affatto. Utilizzando telecamere avanzate e programmi informatici, gli scienziati possono osservare le cellule viventi mentre crescono e cambiano, catturando migliaere di immagini nell'arco di giorni o settimane senza aggiungere nemmeno una goccia di colorante. Questo metodo "label-free" (senza marcatori) promette una visione più chiara e onesta della vita cellulare. È particolarmente vitale per industrie emergenti come la carne coltivata, dove gli scienziati devono far crescere grandi quantità di grasso animale e muscolo in laboratorio, e per la ricerca medica sull'obesità e il diabete, dove comprendere la tempistica precisa della formazione delle cellule adipose è cruciale. La sfida, tuttavia, è stata insegnare ai computer di riconoscere accuratamente queste cellule nelle immagini, poiché le cellule spesso si aggregano e appaiono molto simili tra loro.

In uno studio recente, i ricercatori si sono posti l'obiettivo di testare due modi diversi di utilizzare questa tecnologia label-free per tracciare le cellule staminali mesenchimali, cellule versatili capaci di trasformarsi in grasso. Queste cellule sono state prelevate sia da esseri umani che da maiali, riflettendo il duplice interesse per la salute umana e la produzione di carne sostenibile. Il team ha confrontato due strategie distinte. La prima era un sistema software integrato fornito dal produttore del dispositivo di imaging live-cell, progettato per essere facile da usare e integrato direttamente nel microscopio. La seconda era un modello informatico personalizzato, addestrato dai ricercatori stessi utilizzando uno strumento potente e open-source chiamato Cellpose, progettato per aiutare i computer a "vedere" e separare le singole cellule in immagini complesse.

I ricercatori hanno fatto crescere queste cellule in laboratorio, osservandole moltiplicarsi e poi guidandole a diventare cellule adipose. Hanno scattato foto alle colture ogni ora per diversi giorni, creando una vasta libreria di immagini che mostrano le cellule in ogni fase della loro vita. Hanno poi fatto passare le stesse immagini attraverso sia il software integrato che il loro modello personalizzato per vedere quale dei due potesse contare le cellule e misurare la loro crescita in modo più accurato. Quando si trattava di contare le cellule durante la proliferazione, entrambi i metodi funzionavano bene, ma avevano punti di forza differenti. Il software integrato era eccellente nel gestire scene affollate dove le cellule erano stipate strettamente, fornendo un conteggio affidabile anche quando il piatto era pieno. Il modello personalizzato, invece, era superiore a basse densità, dove poteva distinguere chiaramente le singole cellule e contarle con alta precisione, anche quando stavano solo iniziando a crescere.

La storia è diventata più interessante quando le cellule hanno iniziato a trasformarsi in grasso. Man mano che le cellule si differenziavano, iniziavano a riempirsi di goccioline lipidiche, ovvero minuscole bolle di grasso all'interno della cellula. Il software integrato era molto bravo a individuare queste cellule adipose mature perché appaiono diverse e hanno un contrasto maggiore rispetto alle altre cellule. Poteva dire ai ricercatori quanta parte del piatto fosse coperta da queste cellule adipose mature. Tuttavia, faticava a vedere le prime fasi del processo, perdendo le cellule che avevano appena iniziato a cambiare ma non si erano ancora riempite di abbastanza grasso da risaltare. Il modello personalizzato, d'altra parte, era stato addestrato per riconoscere la forma delle cellule stesse, non solo il grasso al loro interno. Ciò gli ha permesso di individuare i primissimi segni di differenziazione, identificando le cellule che stavano iniziando a impegnarsi nel diventare grasso molto prima che fossero completamente mature. Questo ha fornito ai ricercatori una visione più precoce e dettagliata della trasformazione.

Lo studio ha anche testato se questi modelli informatici potessero funzionare tra diverse specie e diversi tipi di microscopi. Il modello personalizzato, inizialmente addestrato su immagini di cellule di maiale, non riusciva a riconoscere automaticamente le cellule umane senza essere riaddestrato, evidenziando come questi programmi informatici abbiano bisogno di esempi specifici per imparare. Tuttavia, una volta che i ricercatori hanno addestrato una nuova versione del modello sulle cellule umane, ha funzionato altrettanto bene. Inoltre, hanno dimostrato che questi modelli non sono limitati al sistema di imaging ad alta tecnologia utilizzato nel laboratorio. Hanno applicato con successo i loro modelli personalizzati a immagini scattate con microscopi standard e manuali, dimostrando che questa tecnologia può essere utilizzata in molti laboratori diversi, non solo in quelli dotati di attrezzature automatizzate costose.

Uno dei risultati più significativi è stata la capacità di vedere le variazioni nascoste all'interno di un singolo piatto di coltura. Poiché il sistema di imaging scattava foto di molte zone diverse del piatto nel tempo, i ricercatori hanno potuto vedere che le cellule adipose non si formano tutte contemporaneamente o negli stessi posti. Alcune aree del piatto erano piene di cellule adipose, mentre altre rimanevano vuote. Questo tipo di dettaglio spaziale sarebbe stato impossibile da vedere con i metodi tradizionali, che solitamente scattano un'unica foto dal centro del piatto alla fine dell'esperimento. Il monitoraggio continuo ha anche rivelato che lotti diversi di cellule, anche provenienti dallo stesso tipo di animale, si comportavano in modo differente. Alcuni lotti di cellule si trasformavano in grasso in modo rapido ed efficiente, mentre altri faticavano, una variazione che potrebbe essere fondamentale per produrre carne coltivata costante o per comprendere perché alcune persone siano più soggette all'obesità.

In definitiva, lo studio ha dimostato che l'imaging label-free è uno strumento potente che elimina la necessità di procedure di colorazione sporche e distruttive. Permette agli scienziati di osservare l'intero ciclo di vita di una popolazione cellulare in tempo reale, dal momento in cui vengono seminati al momento in cui diventano cellule adipose specializzate. Mentre il software integrato offre una soluzione pratica e pronta all'uso che funziona bene per le cellule mature, i modelli addestrati su misura forniscono un livello di flessibilità e dettaglio senza pari, capaci di individuare i cambiamenti precoci e di adattarsi a diversi tipi di cellule e configurazioni di microscopi. Combinando questi approcci, i ricercatori possono ora tracciare la dinamica della crescita cellulare e della formazione del grasso con una chiarezza precedentemente fuori portata, offrendo nuove intuizioni sia per la scienza medica che per il futuro della produzione alimentare. Tutti i modelli informatici sviluppati in questo studio sono stati resi pubblici, permettendo ad altri scienziati di utilizzare e migliorare questi strumenti per la propria ricerca.