An Instrument for Physical Vapor Deposition onto Cryo-EM Samples for Microsecond Time-Resolved Cryo-EM

本論文は、凍結グリッド onto 化合物を堆積させ、その後のレーザー閃光融解によりマイクロ秒時間分解実験を可能にするクライオ-EM 試料用物理気相堆積装置の設計と動作を提示し、シール膜の最適化およびタンパク質ダイナミクスの開始におけるその有用性を実証する。

要約

細胞内のあらゆる作業を行う微小な機械であるタンパク質の、高速写真を撮影しようとしていると想像してください。通常、電子顕微鏡でこれらの写真を撮影するには、科学者たちはタンパク質を瞬間的に凍結する必要があります。まるで空中でハエを瞬時に冷凍するかのようにです。これは**クライオ電子顕微鏡法（Cryo-EM）**と呼ばれます。

しかし、問題があります。一度凍結されると、タンパク質は固定されてしまいます。動くことができないため、その働きを見ることはできません。最近、科学者たちは、これらの凍結サンプルをマイクロ秒というごくわずかな時間だけ「瞬間的に解凍」し、その後再び瞬時に凍結する方法を見出しました。これにより、彼らはタンパク質を運動の最中に捉えることができます。まるでダンサーがジャンプしている瞬間を撮影するかのようにです。

しかし、そこには一つの難点がありました。氷を溶かすと、タンパク質は小さな水滴の中に浮かびます。その水滴が空気に触れると、タンパク質は表面に付着して自由に回転できなくなり、あらゆる角度から観察することが難しくなります。また、タンパク質が新しい化学物質（薬など）にどのように反応するかを研究したい場合、凍結したサンプルの上に単に化学物質を注いでも、それは混ざり合いません。

解決策：凍結サンプル用の「真空ペイントスプレー」

この論文は、これらの問題を解決するために構築された新しい機械について記述しています。これは、凍結された顕微鏡スライド用に特別に設計された、ハイテクな真空密閉スプレーブースのようなものです。

以下に、簡単なアナロジーを用いてその仕組みを説明します。

1. 「サンドイッチ」技法（サンプルの密封）
凍結されたタンパク質を、繊細なサンドイッチだと想像してください。通常、その上下は空気にさらされています。新しい機械は、サンドイッチがまだ凍った状態で、その上下に「ガラス」（二酸化ケイ素）の極めて薄い層をスプレーすることができます。

• なぜこれを行うのか？ 内部の水が溶けたときに蒸発しないように密封するためです。また、タンパク質を空気から遠ざけ、レーザーが氷を溶かしたときに自由に回転できるようにするためです。
• 発見： 科学者たちは、この「ガラス」がどれほど薄くできるかをテストしました。ガラスが薄すぎると（2 原子層未満）、微小な穴が生じ、水が漏れ出してしまいます。しかし、2 原子層をわずかに超える厚さであれば、完全に保持することがわかりました。これが使用可能な最も薄い「密封」です。

2. 「魔法の粉」技法（化学物質の混合）
凍ったケーキがあると想像してください。そして、ケーキを溶かすことなく、そこにチョコレートチップを加えたときに何が起こるかを見てみたいとします。

• 従来の方法： 凍結サンプルでは、これは実際にはできませんでした。
• 新しい方法： この機械は、化学物質（カルシウム塩など）の微細な粉を凍結サンプルの上にスプレーすることができます。その粉は、上に乗って待機します。
• トリガー： 科学者がレーザーパルスでサンプルを照射して一瞬だけ氷を溶かすと、氷は水に変わり、「粉」は瞬時に溶解してタンパク質と混ざり合います。
• 証明： 科学者たちは、赤く光る特別な染料を含むサンプルにカルシウムの粉をスプレーすることでこれをテストしました。レーザーが氷を溶かすと、カルシウムが染料と混ざり合い、光が弱まりました。これは、化学物質が瞬時に完全に混ざり合ったことを証明しました。

なぜこれが重要なのか
この機械は、凍結生物学のための万能リモコンのようなものです。科学者たちは以下を行うことができます。

1. 保護： 蒸発したり付着したりしないようにサンプルを保護する。
2. 添加： 実験が始まる前に、サンプルが凍結された後に、サンプルに成分（薬や化学物質など）を追加する。
3. 即時混合： レーザーで氷を溶かすことですべてを瞬時に混合し、観察したい瞬間に反応をトリガーする。

著者らは、この機械が将来の実験における標準的な「キッチン」になる可能性があると提案しています。そこでは、科学者たちは成分の添加とサンプルの瞬間的解凍を交互に行うことで、複雑な多段階の実験を構築でき、サンプルを一度も機械から取り出すことなく作業を進めることができます。

まとめ
この論文は、科学者が保護用のガラスや化学物質の粉で凍結サンプルを「塗装」できるツールを紹介しています。彼らがレーザーでサンプルを照射すると、氷は溶け、塗料は液体に変わり、化学物質は瞬時に混ざり合います。これにより、彼らはタンパク質の動きと反応をリアルタイムで観察することができ、凍結サンプルに成分を瞬時に混合させるという問題が解決されました。

技術概要

技術概要：マイクロ秒時間分解クライオ電子顕微鏡のためのクライオ-EM サンプルへの物理気相堆積用装置

問題と背景
レーザーフラッシュ融解に基づくマイクロ秒時間分解クライオ電子顕微鏡（クライオ-EM）は、最近、タンパク質のマイクロ秒時間スケールでの運動の観測を可能にしました。この技術は、ダイナミクスを開始するためにレーザーパルスで凍結サンプルを短時間融解し、その後、過渡的な配置を捕捉するために急速な再ガラス化を行うことを含みます。このアプローチはクライオ-EM の時間分解能を拡大しましたが、サンプル調製における新たな機会も明らかにしました。具体的には、フラッシュ融解前に凍結サンプル上に化合物を堆積させる能力は、サンプル環境を動的に変化させる方法を提供します。以前の研究では、非晶質氷や二酸化ケイ素膜を堆積させることで、空気 - 水界面から粒子を分離し、好ましい粒子配向を軽減できることが示されました。しかし、真空環境内で非揮発性化合物を直接クライオ-EM サンプル上に物理気相堆積（PVD）を行う専用の装置が存在しなかったため、これらの実験において試薬を導入したり、極薄の液体セル幾何学を形成したりする能力が制限されていました。

手法
著者は、クライオ-EM サンプルへの物理気相堆積のために設計されたカスタム真空装置の設計と動作について記述しています。この装置は、$3 \times 10^{-8}$ mbar まで排気された 6 路ステンレス鋼真空チャンバーを備えています。クライオ-EM サンプルは、JEOL 2010 透過電子顕微鏡から流用されたロードロックを介してロードされ、モーター駆動の回転ステージに統合されています。このセットアップにより、サンプルホルダーを回転させることができ、サンプルの片側または両側への堆積を可能にします。

このシステムは 2 つの堆積モードをサポートします：

1. ガスドーシング：揮発性化合物をガスドーシングバルブを通じて導入し、サンプルの両側に同時に堆積させることができます。
2. 電子ビーム蒸着：低蒸気圧化合物を電子ビーム蒸着器を使用して堆積させます。システムは、抵抗加熱タングステンコイルから生成された電子ビームで加熱されるグラファイトライナー付きタンタルるつぼを利用します。拡散ビームは 1 mm の開口部を通じて形成されます。

精密な制御を確保するために、堆積速度は、拡散ビームの一部をイオン化して生成されるイオン電流に基づくフィードバックループを用いて能動的に安定化されます。この信号は、水晶振動子マイクロバランス（QCM）に対して較正されます。著者は、放射加熱により QCM の読み取り値が実際の速度より約 40% 高いものの、イオン電流と堆積速度の間の線形関係により、所望の速度を迅速に設定できることを指摘しています。サンプルは、ガラス化転移を防ぐために、プロセス全体を通じて低温（約 100 K）に維持されます。

主な貢献と結果
この論文は、2 つの主要な実証を通じて装置の詳細な特性評価を提供します：

1. 最小膜厚の決定：著者は、この装置を使用してクライオ-EM サンプル上に二酸化ケイ素（$SiO_2$）膜を堆積させ、極薄の液体セルを作成しました。これらの膜がフラッシュ融解と再ガラス化プロセスに耐え、破損せずに機能するために必要な最小厚さを調査しました。

   • 約**0.75 nm（約 2 単分子層）**の膜は、サンプルを効果的に密封し、30 µs のレーザーパルスの後、蒸発を防ぎ、均一な薄い液体膜を維持しました。
   • **約 0.5 nm（2 単分子層未満）**にまで薄められた膜は失敗し、孔を通じたサンプルの蒸発を示すコントラストの変化を呈しました。
   • これにより、この幾何学における密封膜の機能的な最小厚さは 2 単分子層をわずかに超えることが確立されました。

2. マイクロ秒混合実験：著者は、試薬をサンプル上に堆積させることでタンパク質のダイナミクスを開始する可行性を実証しました。

   • カルシウム感知染料であるフーラレッドを含むクライオ-EM サンプルを調製しました。
   • 無水塩化カルシウム（$CaCl_2$）の 0.5 nm 層をサンプルの片側に気相堆積させました。
   • 50 µs のレーザーパルスによるフラッシュ融解により、カルシウムイオンがサンプルと混合されました。
   • 蛍光顕微鏡により、再ガラス化領域におけるフーラレッドの蛍光強度が低下し、カルシウムイオンが染料に結合したことが確認されました。堆積した$CaCl_2$のない対照実験では、そのようなコントラストの変化は見られませんでした。

意義と主張
著者は、この装置がマイクロ秒時間分解クライオ-EM のための統合プラットフォームの基盤を形成すると主張しています。凍結サンプルへの化合物の物理気相堆積を可能にすることで、このシステムは以下を可能にします：

• 薄膜を安定化し、観測ウィンドウを数十マイクロ秒から数百マイクロ秒に延長する極薄液体セルの作成。
• 試薬（小分子やリガンドなど）を堆積させ、フラッシュ融解時にサンプルと迅速に混合することで、光ケージ化合物を必要とせずにタンパク質ダイナミクスを開始する新たな戦略。
• 将来的に、ペプチドやタンパク質などのより大きく非揮発性の生体分子を堆積させるためのソフトランディング質量分析法との統合の可能性。

この論文は、この統合アプローチが転送を最小化することでサンプル汚染を低減し、堆積とレーザー再ガラス化を交互に行う複雑な実験シーケンスを可能にすることで、アクセス可能なタンパク質ダイナミクスの範囲を拡大すると結論付けています。