Tunable supramolecular polymerization from protein charge heterogeneity and architecture

기술 요약: 단백질 전하 불균일성 및 구조적 설계를 통한 조절 가능한 초분자 중합

문제 제기
접힌 기능적 도메인(folded functional domains)과 유연한 비구조적 영역(flexible unstructured regions)을 모두 포함하는 다중 도메인 단백질은 세포 신호 전달 과정에서 상호작용하는 분자들의 국소적 농축을 용이하게 하며, 이는 어디에나 존재한다. 구조화된 도메인이 고차 구조의 조립을 유도하고, 유연한 영역이 동역학을 조절하거나 응집을 억제한다는 점은 알려져 있으나, 이 두 가지 구조적 특징이 단일 단백질 내에서 어떻게 협력하여 초분자 중합체의 크기, 구조 및 동역학을 조절하는지에 대한 구체적인 메커니즘은 여전히 불분명하다. 특히, 구조화된 도메인 내의 불균일한 전하 분포가 조립 역학에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 유연한 비구조적 영역이 자기 조립의 지속을 어떻게 조절하는지는 알려져 있지 않다.

방법론
본 연구는 모델 시스템으로 출아 효모(budding yeast)의 극성 단백질인 Bem1을 사용하여 실험적 접근법과 계산적 접근법을 결합하여 사용하였다.

• 실험적 접근: 저자들은 전체 길이의 Bem1, 분리된 PB1 도메인(Bem1-PB1), 그리고 PB1 도서가 제거된 Bem1 변이체(Bem1ΔPB1)를 정제하였다. 분자량 분포와 올리고머의 중량 분율을 결정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피-다각도 광산란법(SEC-MALS)을 활용하였다. 필라멘트의 형태, 길이 및 지속 길이를 시각화하기 위해 음성 염색 투과 전자 현미경(nsEM)을 사용하였다. 정전기적 표면 전위는 AlphaFold로 예측된 구조에 대해 적응형 포아송-볼츠만 솔버(APBS)를 사용하여 계산되었다.
• 계산적 접근: 물리적 메커니즘을 분리하기 위해 최소한의 거친 입자 분자 동역학(coarse-grained MD) 시뮬레이션을 개발하였다. 두 가지 모델이 구축되었다:
  1. 5-비드 모델: 전하의 극성을 띠는 PB1 도메인을 서로 반대되는 전하를 가진 극(poles)과 중성 중앙 비드를 가진 삼각 쌍뿔 형태로 나타낸다.
  2. 6-비드 모델: 5-비드 모델을 확장하여, 유연한 링커를 통해 연결된 전체 길이 단백질의 나머지 부분(구조적 및 비구조적 영역)을 나타내는 더 큰 중성 비드를 추가하였다.
     시뮬레이션에서는 조립 동역학 및 열역학을 조절하기 위해 극 전하($q$), 극 간 거리($d_{pole}$), 도메인과 부착된 비드 사이의 거리($d_{other}$), 그리고 회전 강성($k_{angle}$)을 변화시켰다.

주요 결과

• 실험적 관찰: 전체 길이의 Bem1은 단량체에서 18량체에 이르는 역동적이고 다분산적인 다량체로 자발적으로 조립되며, 단량체와 삼량체 쪽으로 편향된 양상을 보인다. nsEM은 이것들이 길쭉하고 굽어 있으며 불규칙한 구조를 형성함을 보여준다. 반면, 분리된 PB1 도메인은 실질적으로 더 길고 가늘며 풍부한 필라멘트(최대 마이크로미터 단위)를 형성하는 반면, Bem1ΔPB1은 주로 단량체 상태로 머물러 있다. 이는 PB1 도메인이 조립을 주도하는 반면, 나머지 단백질 구조가 필라멘트 성장을 제한한다는 것을 나타낸다.
• 전하 불균일성: PB1 도메인은 강한 극성 표면 전하 분포(반대되는 양전하 및 음전하 극)를 보인다. 5-비드 모델 시뮬레이션은 극 전하의 크기($q$)가 가역적 중합의 정도를 조절함을 보여준다. 좁은 범위($3e \leq q \leq 5e$) 내에서 시스템은 조절 가능한 중합을 나타내며, 전하가 더 높을 때($q \geq 5e$) 중합은 포화되지만 여전히 가역적이며, 실험적 PB1 필라멘트와 일치하는 넓은 사슬 길이 분포를 생성한다. 이러한 조립체의 중량 분포는 정량적으로 가역적 Flory 유사 중합 이론을 따른다.
• 구조적 조절: 전체 길이의 Bem1을 모사한 6-비드 모델은 부착된 "나머지" 비드가 극성 도메인을 입체적으로 차폐함을 보여준다. 이러한 입체적 방해는 링커의 회전 유연성과 결합하여, 사슬 길이 분포를 5-비드 모델에 비해 현저히 짧은 중합체(이량체에서 오량체) 쪽으로 이동시킨다.
• 자기 제한 메커니로: 6-비드 모델에서 Flory 이론으로부터의 이탈은 형태 의존적 차폐로 인해 유효 결합 확률이 사슬을 따라 비균일해지기 때문에 발생한다. 본 연구는 회전 유연성을 핵심적인 물리적 파라미터로 식별하였다: 자유롭게 회전하는 부착 비드는 차폐된 결합되지 않은 상태를 선호하게 하는 엔트로피 장벽을 생성하여 추가적인 조립을 억제한다. 이 연결을 강직하게 만들면 이러한 엔트로피 장벽이 감소하여 더 긴 사슬을 형성할 수 있다.

주요 기여

1. 동력원 식별: 본 논문은 PB1 도메인의 전하 극성이 Bem1 자기 조립의 주요 동력인 반면, 나머지 단백질 구조는 필라멘트 길이를 제한하는 조절 역할을 한다는 것을 확립하였다.
2. 물리적 메커니즘: 다중 도메인 단백질의 초분자 중합이 두 가지 뚜렷한 물리적 파라미터, 즉 (i) 접힌 도메인의 극 전하 불균일성 크기와 (ii) 전체 단백질 구조가 부과하는 회전 유연성 및 입체적 제약에 의해 조절될 수 있음을 입증하였다.
3. 이론적 프레임워크: 본 연구는 단순한 전하 극성 도메인이 가역적 Flory 유사 중합을 따르는 반면, 유연한 구조 내에 삽입되면 비균일한 반응성과 자기 제한적 조립 거동을 도입하여 표준 Flory 이론에서 벗어난다는 것을 검증하였다.

의의
저자들은 본 연구가 다중 도메인 단백질이 조절 가능한 생체 분자 구조로 조립되는 과정을 이해하기 위한 일반적인 프레임워크를 제공한다고 주장한다. 전하 극성과 구조적 유연성을 프로그래밍 가능한 "제어 노브(control knobs)"로 식별함으로써, 본 연구는 서열에 인코딩된 상호작용과 구조에 인코딩된 기하학적 조절이 자기 조립을 공동으로 지배하는 설계 원리를 제시한다. 이러한 통찰은 서열 기반의 "스티커-스페이서(sticker-spacer)" 모델과 구조 모델 사이의 간극을 메우며, 초분자 조립을 예측하고 잠재적으로 설계할 수 있는 경로를 제공한다. 연구 결과는 근본적인 인력(attractive interactions)이 변하지 않더라도 입체적 및 기하학적 제약으로부터 자기 제한적 조립이 나타날 수 있음을 강조한다.