Tunable supramolecular polymerization from protein charge heterogeneity and architecture

Technische Samenvatting: Instelbare supramoleculaire polymerisatie vanuit eiwitlading-heterogeniteit en architectuur

Probleemstelling
Multidomein-eiwitten die zowel gevouwen functionele domeinen als flexibele ongestructureerde regio's bevatten, zijn alomtegenwoordig in cellulaire signalering, waar ze de lokale verrijking van interagerende moleculen faciliteren. Hoewel gestructureerde domeinen bekend staan om het aansturen van hogere-orde assemblage en flexibele regio's om kinetiek te moduleren of aggregatie te onderdrukken, blijft het specifieke mechanisme waarmee deze twee architecturale kenmerken binnen één enkel eiwit samenwerken om de grootte, structuur en kinetiek van supramoleculaire polymeren te reguleren, onduidelijk. Specifiek is het onbekend hoe heterogene ladingverdelingen binnen gestructureerde domeinen de assemblage-dynamiek beïnvloeden en hoe flexibele ongestructureerde regio's de voortzetting van zelfassemblage reguleren.

Methodologie
De studie maakt gebruik van een gecombineerde experimentele en computationele benadering met behulp van het knopvormende gist-polariteitseiwit Bem1 als model-systeem.

• Experimentele benadering: De auteurs zuiverden volledig Bem1, een geïsoleerd PB1-domein (Bem1-PB1) en een Bem1-mutant zonder het PB1-domein (Bem1ΔPB1). Ze gebruikten Size-Exclusion Chromatography met Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS) om de moleculaire massaverdelingen en gewichtsfracties van oligomeren te bepalen. Negative-stain Transmissie Elektronenmicroscopie (nsEM) werd gebruikt om de filamentmorfologie, lengte en persistentielengte te visualiseren. Elektrostatische oppervlaktepotentialen werden berekend met de Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS) op AlphaFold-voorspelde structuren.
• Computationele benadering: Minimale coarse-grained moleculaire dynamica (MD) simulaties werden ontwikkeld om fysieke mechanismen te isoleren. Twee modellen werden geconstrueerd:
  1. 5-bead model: Vertegenwoordigt het lading-polaire PB1-domein als een driehoekige bipyramide met tegenovergestelde geladen beads (polen) en neutrale centrale beads.
  2. 6-bead model: Breidt het 5-bead model uit door een grotere neutrale bead toe te voegen die de rest van het volledige eiwit (gestructureerde en ongestructureerde regio's) vertegenwoordigt, verbonden via een flexibele linker.
     Simulaties varieerden de poollading ($q$), de pool-tot-pool afstand ($d_{pole}$), de afstand tussen het domein en de aangehangen bead ($d_{other}$), en de rotationele stijfheid ($k_{angle}$) om assemblagekinetiek en thermodynamica af te stemmen.

Belangrijkste Resultaten

• Experimentele Observaties: Volledig Bem1 assembleert spontaan tot dynamische, polydisperse multimeren variërend van monomeren tot 18-meren, met een bias naar monomeren en trimeren. nsEM laat zien dat deze langgerekte, gebogen en onregelmatige structuren vormen. In tegen tegenstelling hiertoe vormen de geïsoleerde PB1-domeinen substantieel langere, dunnere en meer overvloedige filamenten (tot micrometers), terwijl Bem1ΔPB1 overwegend monomeer blijft. Dit geeft aan dat het PB1-domein de assemblage aandrijft, terwijl de rest van de eiwitarchitectuur de filamentgroei beperkt.
• Lading-heterogeniteit: Het PB1-domein vertoont een sterk polaire oppervlakteladingverdeling (tegenovergestelde positieve en negatieve polen). Simulaties van het 5-bead model laten zien dat de magnitude van de poollading ($q$) de omvang van reversibele polymerisatie afstemt. Binnen een nauw regime ($3e \leq q \leq 5e$) vertoont het systeem instelbare polymerisatie; bij hogere ladingen ($q \geq 5e$) verzadigt de polymerisatie maar blijft deze reversibel, wat brede ketenlengteverdelingen produceert die consistent zijn met experimentele PB1-filamenten. De gewichtsverdeling van deze assemblages volgt kwantitatief de reversibele Flory-achtige polymerisatietheorie.
• Architecturale Regulatie: Het 6-bead model, dat het volledige Bem1 nabootst, laat zien dat de aangehangen "rest"-bead het polaire domein sterisch afschermt. Deze sterische hinder, gecombineerd met de rotationele flexibiliteit van de linker, verschuift de ketenlengteverdeling naar significant kortere polymeren (dimeren tot pentameren) vergeleken met het 5-bead model.
• Mechanisme van Zelfbeperking: De afwijking van de Flory-theorie in het 6-bead model komt voort uit het feit dat de effectieve associatiekans niet uniform wordt langs de keten door conformatie-afhankelijke afscherming. De studie identificeert rotationele flexibiliteit als een cruciale fysieke parameter: een vrij roterende aangehangen bead creëert een entropische barrière die de afgeschermde, niet-gebonden staat bevoordeelt, waardoor verdere assemblage wordt geremd. Het verstijven van deze verbinding vermindert deze entropische barrière en staat langere ketens toe.

Belangrijkste Bijdragen

1. Identificatie van Drivers: Het artikel stelt vast dat de lading-polariteit van het PB1-domein de primaire drijfveer is voor de Bem1 zelfassemblage, terwijl de resterende eiwitarchitectuur fungeert als een instelbare regulator die de filamentlengte beperkt.
2. Fysisch Mechanisme: Het toont aan dat supramoleculaire polymerisatie in multidomein-eiwitten kan worden afgestemd door twee verschillende fysieke parameters: (i) de magnitude van de polaire lading-heterogeniteit in gevouwen domeinen en (ii) de rotationele flexibiliteit en sterische beperkingen opgelegd door de algemene eiwitarchitectuur.
3. Theoretisch Kader: De studie valideert dat eenvoudige lading-polaire domeinen de reversibele Flory-achtige polymerisatie volgen, terwijl het inbedden van deze domeinen in flexibele architecturen niet-uniforme reactiviteit en zelflimiterende assemblagegedragingen introduceert die afwijken van de standaard Flory-theorie.

Significantie
De auteurs stellen dat hun werk een algemeen kader biedt voor het begrijpen van hoe multidomein-eiwitten assemblagebare, instelbare biomoleculaire structuren vormen. Door lading-polariteit en architecturale flexibiliteit als programmeerbare "controleknoppen" te identificeren, suggereert de studie een ontwerpprincipe waarbij sequentie-gecodeerde interacties en architectuur-gecodeerde geometrische regulatie gezamenlijk de zelfassemblage beheersen. Dit inzicht overbrugt de kloof tussen sequentie-gebaseerde "sticker-spacer"-modellen en structurele modellen, en biedt een pad om supramoleculaire assemblages voor cellulaire signaleringsprocessen te voorspellen en potentieel te ontwerpen. De bevindingen benadrukken dat zelflimiterende assemblage kan voortkomen uit sterische en geometrische beperkingen, zelfs wanneer de onderliggende aantrekkende interacties onveranderd blijven.