Structural and functional heterogeneity in cardiac RyR signalling nanodomains revealed with quantitative single molecule mapping toolkit

기술 요약: 정량적 단일 분자 매핑 툴킷을 통해 밝혀진 심장 RyR 신호 전달 나노도메인의 구조적 및 기능적 이질성

문제 제기
Type-2 ryanodine 수용체(RyR2) 채널과 이들의 테더링 단백질인 junctophilin-2(JPH2)의 공간적 조직화는 심장 칼슘(Ca²⁺) 방출 충실도의 결정적인 결정 요인이다. 심부전이 트랜스버스 튜뷸(transverse-tubule) 시스템, 다이아딕(dyadic) 구조, 그리고 RyR 클러스터링을 저해한다는 점은 이미 확립되어 있으나, 폐동맥 고혈압(PAH)에 의한 우심실(RV) 부전에서 나타나는 나노스케일 리모델링의 구체적인 성격은 여전히 잘 알려져 있지 않다. 기존 연구들은 질병이 단백질 함량과 인산화를 변화시킨다고 제안하지만, 개별 서브사르코레마(subsarcolemmal) Ca²⁺ 방출 나노도메인 내에서 RyR2와 JPH2의 정량적 화학양론(stoichiometry), 공간적 공동 클러스터링(co-clustering), 그리고 세포 전체의 이질성이 어떻게 변화하는지는 불분명하다. 또한, 이러한 구체적인 구조적 변화가 자발적 Ca²⁺ 파동의 전파에 미치는 기능적 결과가 실험적으로 도출된 분자 지도와 어떻게 직접적으로 연결되는지도 밝혀지지 않았다.

방법론
저자들은 다중화된 DNA-PAINT(Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)와 정량적 단일 분자 계수(qPAINT), 그리고 이미지 기반 확률적 시뮬레이션을 결합한 통합 분석 파이프라인을 개발하였다.

1. 시료 준비: 대조군 쥐와 PAH 유도 우심실 부전(모노크로탈린(MCT)에 의해 유도됨) 모델 쥐로부터 심실 심근세포를 효소적으로 분리하였다. 세포를 고정한 후 Exchange-PAINT 이미징을 수행하였다.
2. 이미징 프로토콜: RyR2와 JPH2를 고유한 DNA 도킹 가닥(docking strands)으로 면역 표지하였다. 상보적인 형광 이미서 가닥(Atto655)을 사용하여 각 표적을 시각화하기 위해 순차적인 이미징 라운드를 수행하였다. 데이터는 TIRF 현미경을 통해 획득되었다.
3. 데이터 처리 파이프라인 (PyME): 저자들은 오픈 소스인 Python Microscopy Environment (PyME)를 사용하여 다음을 포함하는 워크플로를 구현하였다:
   • 이벤트 필터링 및 드리프트 보정: 저품질 국소화(localization) 제거 및 측면 드리프트 보정.
   • 합병(Coalescence): 단일 도킹 가닥의 과샘플링을 방지하기 위해 시간적으로 인접한 이벤트들을 병합.
   • 세그멘테이션(Segmentation): 밀도 지도를 기반으로 RyR 클러스터 식별.
   • qPAINT 분석: 각 세그먼트된 클러스터 내에서 접근 가능한 RyR 및 JPH2 표적의 절대 수를 추정하기 위해 "QIndex"(특성 암흑 시간의 역수)를 계산.
4. 공간 분석:
   • 화학양론: 클러스터당 RyR:JPH2 비율 계산.
   • 공동 국소화(Co-localisation): 이동 창(moving windows) 내에서 피어슨 상관계수와 Manders 계수를 계산하고, 공동 표지(co-label)의 50%를 포함하는 데 필요한 거리를 측정하기 위해 유클리드 거리 변환(EDT)을 적용.
   • 이질성: 공간적 이질성을 100–1000 nm 길이 스케일에서 정량화하기 위해 가우시안 랜덤 필드(GRF) 분석 및 경험적 세미-바리오그램(semi-variogram) 적용.
5. 시뮬레이션: 실험적으로 도출된 RyR 및 JPH2 위치의 2D 지도를 Ca²⁺ 방출의 확률적 반응-확산 모델을 위한 구조적 템플릿으로 사용하였다. 모델에는 JPH2 의존적 RyR 민감도 조절을 포함하여 자발적 Ca²⁺ 파동 전파를 시뮬레이션하였다.

주요 결과

• 정량적 화학양론: MCT 유도 부전 세포에서 중앙값 RyR:JPH2 화학양론 비율은 대조군에 비해 14% 감소하였다. 결정적으로, 이 비율의 분산이 부전 세포에서 유의하게 증가하였는데, 이는 공동 클러스터링의 감소가 균일하지 않고 세포 표면 전체에서 매우 이질적임을 나타낸다.
• 공간적 디커플링(Decoupling): 전역적 공동 국소화 계수는 유의미한 변화가 없었으나, 국소적 Manders 계수의 분산은 부전 세포에서 2.3배 증가하였다. EDT 분석 결과, RyR 대비 JPH2 신호의 50%를 포함하는 데 필요한 거리가 부전 시 유의하게 증가하였으며, 이는 질병 상태에서 JPH2가 RyR 도메인으로부터 멀어지거나 주변 농도가 낮아짐을 시사한다.
• 스케일 특이적 이질성: 세미-바리오그램 분석은 서로 다른 리모델링 패턴을 보여주었다. 부전 세포의 RyR 지도는 대조군에 비해 낮은 세미-분산(밀도 변동 감소)을 보인 반면, JPH2 지도는 특히 1000 nm에 근접하는 길이 스케일에서 증가된 세미-분산을 보였다. 이는 질병이 두 단백질의 공간적 밀도 변동 크기를 서로 다르게 변화시킨다는 것을 의미한다.
• 시뮬레이션 결과: 실패 세포의 지도를 템플릿으로 사용했을 때, 이들은 대조군 지도에 비해 더 빠른 횡적(transverse) 및 종적(longitudinal) 파동 전파(각각 23% 및 16% 증가)를 지원하였다. 시뮬레이션은 파편화된 RyR 구조와 이질적인 JPH2 분포가 국소적 동기화의 상실에도 불구하고, 더 빠른 도약적(saltatory) 방출 부위 모집을 지원하기에 충분함을 입증하였다.

의의 및 주장
본 논문은 정량적 분자 계수와 이미지 기반 시뮬레이션을 통합함으로써 분자 나노구조와 세포 기능을 연결하는 전이 가능한 툴킷을 구축했다고 주장한다. 주요 발견은 우심실 부전이 단순히 단백질의 균일한 손실이나 구조적 무질서가 아니라, 공간적으로 이질적인 리모델링의 RyR2-JPH2 인터페이스에 의해 특징지어진다는 점을 시사한다.

저자들은 이러한 이질성, 특히 국소적 화학양론의 가변성 증가와 JPH2의 상이한 공간적 변동이 조절되지 않는 Ca²⁺ 신호 전달의 기질을 형성한다고 상정한다. 시뮬레이션 결과는 동기화된 Ca²⁺ 방출은 저해될 수 있지만, 결과적으로 발생하는 이질적인 구조가 자발적인 Ca²⁺ 파동 및 부정맥 유발 전파를 촉진할 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 본 연구는 이 통합된 접근 방식이 인구 통계적 평균을 넘어 국소적 분자 불일치를 해결함으로써, 나노스케일의 구조적 결함이 어떻게 거시적인 세포 기능 장애에 기여하는지를 이해하는 프레임워크를 제공한다고 결론짓는다.