Structural and functional heterogeneity in cardiac RyR signalling nanodomains revealed with quantitative single molecule mapping toolkit

Resumen Técnico: La heterogeneidad estructural y funcional en los nanodominios de señalización de RyR revelada con un kit de mapeo cuantitativo de moléculas individuales

Planteamiento del problema
La organización espacial de los canales de receptor de rianodina de tipo 2 (RyR2) y su proteína de anclaje, la junctofilina-2 (JPH2), es un determinante crítico de la fidelidad de la liberación de calcio (Ca²⁺) cardíaco. Si bien está establecido que la insuficiencia cardíaca altera el sistema de túbulos transversos, la arquitectura diádica y el agrupamiento de RyR, la naturaleza específica de la remodelación a nanoescala en la insuficiencia del ventrículo derecho (VD) inducida por la hipertensión arterial pulmonar (HAP) sigue siendo insuficientemente comprendida. Estudios previos sugieren que la enfermedad altera la abundancia proteica y la fosforilación, pero no está claro cómo la estequiometría cuantitativa, el co-agrupamiento espacial y la heterogeneidad a nivel celular de RyR2 y JPH2 se ven alterados dentro de los dominios individuales de liberación de Ca²⁺ subsarcolemmales. Además, la consecuencia funcional de estos cambios estructurales específicos sobre la propagación de las ondas espontáneas de Ca²⁺ no se ha vinculado directamente con mapas moleculares derivados experimentalmente.

Metodología
Los autores desarrollaron un flujo de análisis integrado que combina DNA-PAINT (acumulación de puntos para imagen en topografía de escala nanométrica) multiplexado con conteo de moléculas individuales cuantitativo (qPAINT) y simulación estocástica basada en imágenes.

1. Preparación de la muestra: Se aislaron cardiocitos ventriculares de ratas control y de ratas con insuficiencia de VD inducida por HAP (inducida por monocrotalina, MCT). Las células fueron fijadas y sometidas a la técnica de imagen Exchange-PAINT.
2. Protocolo de imagen: RyR2 y JPH2 fueron inmunomarcados con anticuerpos conjugados con hebras de anclaje de ADN únicas. Se realizaron rondas de imagen secuenciales utilizando hebras de imagen fluorescentes complementarias (Atto655) para visualizar cada objetivo. Los datos se adquirieron mediante microscopía de reflexión interna total (TIRF).
3. Flujo de procesamiento de datos (PyME): Utilizando el entorno de Python para microscopía de código abierto (PyME), los autores implementaron un flujo de trabajo que incluye:
   • Filtrado de eventos y corrección de deriva: Eliminación de localizaciones de baja calidad y corrección de la deriva lateral.
   • Coalescencia: Fusión de eventos temporalmente adyacentes para evitar el sobremuestreo de hebras de anclaje individuales.
   • Segmentación: Identificación de cúmulos de RyR basados en mapas de densidad.
   • Análisis qPAINT: Cálculo del "QIndex" (el inverso del tiempo oscuro característico) para estimar el número absoluto de objetivos de RyR y JPH2 accesibles dentro de cada cúmulo segmentado.
4. Análisis espacial:
   • Estequiometría: Cálculo de las proporciones RyR:JPH2 por cúmulo.
   • Co-localización: Computación de los coeficientes de correlación de Pearson y de Manders dentro de ventanas móviles, y la Transformada de Distancia Euclídea (EDT) para medir la distancia requerida para abarcar el 50% de la señal co-marcada.
   • Heterogeneidad: Aplicación de análisis de Campo Aleatorio Gaussiano (GRF) y semivariogramas empíricos para cuantificar la heterogeneidad espacial en escalas de longitud (100–1000 nm).
5. Simulación: Los mapas de posiciones de RyR y JPH2 derivados experimentalmente se utilizaron como plantillas estructurales para un modelo de reacción-difusión estocástica de la liberación de Ca²⁺. El modelo incorporó la modulación de la sensibilidad de RyR dependiente de JPH2 para simular la propagación de ondas de Ca²⁺ espontáneas.

Resultos clave

• Estequiometría cuantitativa: En las células con insuficiencia inducida por MCT, la relación estequiométrica mediana de RyR:JPH2 disminuyó un 14% en comparación con los controles. Crucialmente, la varianza de esta relación aumentó significamente en las células con insuficiencia, lo que indica que la reducción en el co-agrupamiento no es uniforme, sino altamente heterogénea a través de la superficie celular.
• Desacoplamiento espacial: Mientras que los coeficientes de co-localización global mostraron cambios insignificantes, la varianza local de los coeficientes de Manders aumentó 2.3 veces en las células con insuficiencia. El análisis EDT reveló un aumento de más de 2 veces en la distancia requerida para abarcar el 50% de la señal de JPH2 en relación con la de RyR, lo que sugiere que la JPH2 retrocede o se vuelve menos concentrada alrededor de los dominios de RyR en la enfermedad.
• Heterogeneidad a escala específica: El análisis de semivariograma mostró patrones de remodelación divergentes. Los mapas de RyR en células con insuficiencia exhibieron una semivarianza menor (reducción de las fluctuaciones de densidad) en comparación con los controles, mientras que los mapas de JPH2 mostraron una mayor semivarianza, particularmente en escalas de longitud que se aproximan a los 1000 nm. Esto indica que la enfermedad altera la magnitud de las fluctuaciones de densidad espacial de forma diferente para ambas proteínas.
• Resultados de la simulación: Al ser utilizados como plantillas para simulaciones de ondas de Ca²⁺, los mapas de las células con insuficiencia sustentaron una propagación de ondas transversales y longitudinales más rápida (aumentos del 23% y 16%, respectivamente) en comparación con los mapas de control. Las simulaciones demostraron que la arquitectura fragmentada de RyR y la distribución heterogénea de JPH2 en las células con insuficiencia son suficientes para facilitar la emergencia de ondas de Ca²⁺ de reclutamiento saltatorio rápido, a pesar de la pérdida de la sincronía local.

Significado y afirmaciones
El artículo afirma establecer un kit de herramientas transferible que vincula la nanoestructura molecular con la función celular al integrar el conteo molecular cuantitativo con la estadística espacial y la simulación basada en imágenes. Los hallazgos principales sugieren que la insuficiencia del VD se caracteriza no meramente por una pérdida uniforme de proteínas o desorden estructural, sino por una remodelación espacialmente heterogénea de la interfaz RyR2-JPH2.

Los autores postulan que esta heterogeneidad —específicamente el aumento en la variabilidad de la estequiometría local y las fluctuaciones espaciales divergentes de JPH2— crea un sustrato para la señalización de Ca²⁺ desregulada. Los resultados de la simulación apoyan la hipótesis de que, si bien la liberación sincrónica de Ca²⁺ puede verse afectada, la arquitectura heterogénea resultante puede facilitar la aparición de ondas de Ca²⁺ espontáneas y la propagación arritmogénica. El estudio concluye que este enfoque integrado proporciona un marco para comprender cómo los defectos estructurales a nanoescala contriben a la disfunción celular macroscópica, yendo más allá de los promedios poblacionales para resolver los desajustes moleculares locales.