Low testosterone promotes anxiety through astrocytic mitochondrial remodelling at the nucleus accumbens blood-brain barrier

기술 요약: 낮은 테스토스테론 수치가 측좌핵 혈액-뇌 장벽 내 성상세포 미토콘드리아 재구성을 통해 불안을 촉진함

문제 제기
지속적인 높은 불안은 스트레스 관련 정신병리의 중요한 위험 요인이지만, 이를 지속시키는 생물학적 기제는 여전히 완전히 이해되지 않은 상태로 남아 있다. 현재의 프레임워크는 신경 회로와 유전학에 집중하고 있으나, 말초 생리학, 특히 내분비 상태가 어떻게 불안 특성에 기여하는지에 대해서는 알려진 바가 적다. 낮은 테스토스테론은 남성에게서 불안 증상과 역학적으로 연관되어 있지만, 인과 관계와 순환 안드로겐 수치를 뇌의 불안 취약성과 연결하는 근저의 뇌 기제는 확립되지 않았다. 또한, 뇌의 항상성을 유지하는 핵심 인터페이스인 혈액-뇌 장벽(BBB)은 안드로겐의 영향을 받는 것으로 알려져 있으나, 감소된 안드로겐 작용이 자연적으로 발생하는 불안 차이와 연관되어 특정 영역에서 신경혈관 인터페이스를 손상시키는지 여부는 알려져 있지 않다.

연구 방법론
본 연구는 고조된 플러스 미로(EPM), 오픈 필드(OF), 신물체(NO) 테스트 전반에 걸친 탐색 행동의 자연적 변이를 바탕으로 외형적 와리스터(Wistar) 쥐 모델을 저불안(LA) 및 고불안(HA) 표현형으로 층화하여 활용하였다.

• 내분비 조작: 인과 관계를 테스트하기 위해, LA 쥐에게 GnRH 길항제인 데가렐릭스(degarelix)를 단회 피하 주사하여 내인성 테스토스테론을 억제하였다. 반대로, HA 쥐와 노령(11개월령) 수컷 쥐(자연적으로 테스토스테론이 낮은 상태)에게는 서방형 테스토스테론 펠릿을 투여하였다.
• 신경혈관 평가: 에반스 블루(Evans Blue) 추출법을 사용하여 측좌핵(NAc), 배측 선조체(DS), 내측 전전두엽 피질(mPFC)의 BBB 투과성을 매핑하였다. NAc 신경혈관 단위의 초미세 구조 분석을 위해 연속 전자 현미경(EM)을 사용하여 성상세포 말단(endfoot) 피복도, 밀착 연접 연속성, 미토콘드리아 형태(밀도, 면적, 소포체 접촉)를 정량화하였다.
• 분자 프로파일링: NAc 성상세포에 대한 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)을 수행하여 미토콘드리아 및 BBB 관련 경로의 전사 변화를 식별하였다. qPCR 및 면역조직화학(IHC)을 통해 Aqp4, Cldn5, Gja1, Mfn2(Mitofusin 2)와 같은 마커를 검증하였다. RNAscope 인시튜 하이브리드화(in situ hybridization)를 통해 성상세포 도메인 내 Mfn2 mRNA를 정량화하였다.
• 유전적 개입: 기제를 확립하기 위해 본 연구는 다음을 활용하였다:
  1. 안드로겐 수용체(AR) 녹다운: HA 쥐에게 테스토스테론 보충 전 NAc 양측에 AAV2-GFP-U6-h-AR-shRNA를 주입하였다.
  2. 성상세포 특이적 과발현: HA 쥐의 NAc에 AAV2/9-GfaABC1D-Mfn2-eGFP를 양측 주입하여 성상세포에서 Mfn2를 특이적으로 과발현시켰다.
• In Vitro 검증: 인간 뇌 미세혈관 내피세포(HBMVEC)를 단독 또는 일차 배양된 인간 성상세포와 함께 배양하여, 테스토스테론과 AR 길항제인 플루타미드(flutamide)에 반응하는 경전두 내 전기 저항(TEER)을 측정하였다.

주요 결과

1. 상관관계 및 인과관계: HA 수컷 쥐는 LA 쥐에 비해 혈장 테스토스테론 수치가 유의하게 낮았으며, 테스토스테론과 불안 z-점수 사이에는 역상관관계가 존재했다. LA 쥐에서 테스토스테론을 약리학적으로 억제했을 때 고불안 유사 행동이 유도됨으로써 인과적 연결을 확인하였다.
2. 영역 특이적 BBB 기능 장애: HA 쥐는 (DS나 mPFC가 아닌) NAc에서 선택적인 BBB 투과성 증가를 보였으며, 이는 불안 점수와 상관관계가 있었다. 이는 성상세포 말단 피복 감소, 내피 밀착 연접의 불연속성 증가, 그리고 밀착 연접 단백질(Aqp4, Cldn5, Gja1)의 발현 변화를 동반했다.
3. 성상세포 미토콘드리아 재구성: HA 표현형은 성상세포 말단의 특정 변화를 특징으로 했다: 미토콘드리아 피복 감소, 더 작은 미토콘드리아 면적, 더 적은 미토콘드리아-소포체(ER) 접촉, 그리고 감소된 Mfn2 발현이 관찰되었다. 내피세포 및 주세포(pericyte)의 미토콘드리아 구조는 변화가 없었다.
4. 테스토스테론 구제 효과: HA 쥐에 테스토스테론을 보충했을 때 불안 유사 행동이 감소하였고, NAc 성상세포의 전사 프로그램이 LA 프로파일로 이동하였다. 구체적으로, 테스토스테론은 AQP4 피복을 회복시키고, Mfn2 펑타(puncta)를 성상세포 도메인 내에 증가시키며, BBB 투과성을 감소시켰다. 노령의 저테스토스테론 수컷 쥐에서도 유사한 구제 효과가 관찰되었다.
5. 기제적 특이성:
   • AR 의존성: NAc의 AR을 녹다운하면 테스토스테론 보충에 따른 행동 및 신경혈관 이점이 감쇄되었으며, 이는 NAc AR 신호 전달의 역할을 확인시켜 준다.
   • Mfn2 충분성: HA 쥐의 NAc에 성상세포 특이적으로 Mfn2를 과발현시키는 것은 전신적 테스토스테론 조작과 무관하게 불안 유사 행동을 감소시키기에 충분했다.
   • In Vitro 기제: 테스토스테론은 성상세포와의 공동 배양에서만 내피 장벽 저항(TEER)을 증가시켰으며, 이 효과는 플루타미드에 의해 차단되었다. 이는 장벽 무결성에 대한 안드로겐 작용이 성상세포 의존적 기제임을 뒷받-받는다.
6. 성별 특이성: 암컷 쥐에서는 수컷에서 관찰된 강력한 행동 분리 및 NAc BBB 투과성과 불안 사이의 상관관계가 나타나지 않았으며, 이는 성별에 따른 신경혈관 기제가 존재함을 시사한다.

의의 및 주장
본 논문은 낮은 내인성 테스토스테론이 지속적인 높은 불안에 대한 인과적 내분비 기여 요인임을 밝혀냈다고 주장한다. 연구진은 전신 안드로겐 상태가 NAc 혈액-뇌 장벽의 혈관 주변 성상세포 내 미토콘드리아 재구성을 통해 불안 취약성을 조절한다는 구체적인 신경혈관 기제를 확립하였다.

본 연구는 전신 생리학적 상태가 신경혈관 인터페이스를 통해 어떻게 지속적인 불안 취약성을 형성할 수 있는지를 입증함으로써, 기존의 회로 중심 모델을 확장한다. 낮은 테스토스테론을 낮은 성상세포 Mfn2 및 후속적인 BBB 기능 장애와 연결함으로써, 저자들은 전신 신호가 뇌 기제에 어떻게 각인되는지에 대한 기능적 경로를 제안한다. 이러한 결과는 Mfn2가 NAc 성상세포의 핵심적인 기능적 구성 요소임을 시사하며, 이는 임상 및 지역사회 인구에서 낮은 테스토스테론, 노화, 그리고 불안 관련 증상 사이의 연관성에 대한 기계적 설명을 제공한다. 본 연구는 NAc 신경혈관 인터페이스가 안드로겐 신호가 미토콘드리아 조직을 관여하여 불안 취약성을 유지하거나 완화하는 지점임을 강조한다.