Spatial and single-nucleus transcriptomics reveal the complexity of genomic imprinting in maize

기술 요약: 공간 및 단일 핵 전사체 분석을 통한 옥수수의 유전체 각인 현상의 복잡성 규명

문제 제기
부모 유래 특이적 유전자 발현을 결정하는 후성유전학적 현상인 유전체 각인(genomic imprinting)은 옥수수 배유(endosperm)에서 처음 발견되었다. 수동으로 분리한 배유와 벌크 RNA 시퀀싱을 이용한 기존 연구들은 수백 개의 추정 각인 유전자를 식별했으나, 배유를 균질한 조직으로 취급하였다. 이러한 접근 방식은 배유가 구성하는 아류레인 층(aleurone layer, AL), 기부 배류 전이층(basal endosperm transfer layer, BETL), 전분 배유(starchy endosperm, SE)와 같은 뚜렷한 기능적 영역들 사이의 심오한 세포 이질성과 공간적 구조를 간과한다. 결과적으로, 각인 패턴이 서로 다른 세포 유형에 따라 변하는지, 혹은 특정 공간 구획에 국한되는지는 여전히 불분명하다. 또한, 옥수수 배아에서의 각인 정도가 배유와 비교하여 어느 정도인지에 대해서도 논쟁이 있어 왔다.

연구 방법론
이러한 공백을 메우기 위해, 저자들은 수분 후 14일(DAP) 된 상호 교배 잡종(B73 × Mo17 및 Mo17 × B73)을 대상으로 공간 전사체 분석과 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)을 결합한 다중 모드 접근 방식을 채택하였다.

• 공간 전사체 분석: 10x Genomics Visium 기술를 사용하여 상호 교배된 커널의 종단 절편을 프로파일링하였다. 이를 통해 공간적 맥락을 유지하면서 특정 해부학적 영역에 유전자 발현을 매핑할 수 있었다.
• 단일 핵 RNA 시퀀싱: 공간 프로파일링과 병행하여, 수동으로 분리된 배유를 DNBelab C4 snRNA-seq에 적용하여 단일 세포 수준에서 세포 이질성을 해결하였다.
• 대립유전자 특이적 분석: 저자들은 각 스팟 또는 핵에서 모계 리드 비율(PMR)을 계산하기 위해 spaceASE라는 파이프라인을 개발하였다. B73과 Mo17 사이의 부모 DNA 다형성(SNP)을 활용함으로써, 서열 의존적 대립유전자 특이적 발현(sdASE)과 진정한 유전체 각인(부모 유래 효과)을 구분하였다.
• 검증 및 통합: 연구팀은 세포 유형별 각인을 검증하기 위해 공간 데이터와 snRNA-seq 데이터를 통합하였다. 또한, DNA 메틸화 패턴을 평가하기 위해 전장 유전체 비설파이트 시퀀싱(WGBS)을 수행하였으며, 긴 읽기 전사체(long-read transcriptome) 데이터를 사용하여 긴 비부호화 RNA(lncRNA)를 주석 달고 정량화하였다.
• 의사시간(Pseudotime) 분석: Monocle2를 사용하여 양쪽 부모 대립유전자에 대한 발달 궤적을 구축함으로써, 배유 분화 과정 중 전사 프로그램의 분화를 조사하였다.

주요 결과

1. ASE 및 각인의 세포 특이성: 본 연구는 6개의 주요 배유 세포 유형을 규명하였다. 대립유전자 특이적 발현(ASE) 유전자의 약 2/3가 단 하나의 세포 유형에서만 발생하는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 공간 전사체 분석으로 식별된 각인 유전자의 70% 이상이 snRNA-seq를 통해 세포 유형 수준에서 검증되었으며, 이 중 절반 미만이 여러 세포 유형에서 나타났다.
2. 부계 발현 유전자(PEGs)의 우세: 분석 결과, 모계 발현 유전자(MEGs)보다 부계 발현 유전자(PEGs)가 전반적으로 우세함이 드러났다. PEGs는 MEGs보다 약 2배 더 많았다. 기능적 농축 분석 결과, MEGs는 후성유전적 조절 및 배아 발달과 관련이 있는 반면, PEGs는 신호 전달, 대사 및 mRNA 가공에 관여하는 것으로 나타났다.
3. 표준 및 신규 유전자의 검증: Fie1, Nrp1, Mez1과 같은 알려진 각인 유전자는 대부분의 세포 유형에서 일관된 모계 발현을 보였다. 그러나 본 연구는 BETL의 Trps8 및 투명 배유(vitreous endosperm, VE)의 Thx41과 같이 수많은 새로운 세포 유형 특이적 각인 유전자를 식별하였다. 특히, Ippi1 유전자는 6개 모든 배유 세포 유형에서 각인되어 있는 것으로 확인되었다.
4. 배아 각인: 배유와 대조적으로, 옥수수 배아에서는 유전체 각인이 드문 것으로 보인다. 추정되는 배아 MEGs는 인접한 배유 조직과 공유되거나 불일치하는 모자이크 패턴을 보였는데, 이는 배아 고유의, 배유와 구별되는 진정한 배아 특이적 각인이 결여되어 있음을 시사한다.
5. 각인된 lncRNA: 본 연구는 lncRNA의 높은 세포 유형 특이성을 규명하였다(76%가 단 하나의 세포 유형에서 검출됨). 새로운 모계 발현 lncRNA인 STRG.27146이 식별되었으며, 이는 표준적인 MEG인 Mez1과 함께 모계 저메틸화 영역에 군집을 이루고 있어, DNA 메틸화와 각인 사이의 기계적 연결 고리를 제공한다.
6. 발달적 분화: 의사시간 분석 결과, 배류 분화가 진행됨에 따라 부모의 전사 프로그램이 분화되는 것이 밝혀졌으며, 발달 궤적의 끝부분(특히 SE 및 EAS)으로 갈수록 부모 대립유전자 간의 이질성이 증가하였다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 수정 후 세포 분화가 옥수수의 유전체 각인의 공간적 및 세포적 복잡성을 형성한다는 증거를 원리 증명(proof-of-principle) 방식으로 제공한다고 주장한다. 벌크 조직 분석에서 세포 유형 해상도로 전환함으로써, 연구는 각인이 균일한 현상이 아니라 매우 맥락 의존적이며 공간적으로 제한되어 있음을 입증한다. 세포 유형별로 정의된 대규모 각인 유전자 세트의 식별은 배류 발달의 기능적 해부를 위한 새로운 자원을 제공한다. 나아가, 모계 저메틸화에 의해 조정되는 각인된 lncRNA 클러스터의 발견은 식물의 후성유전적 조절에 대한 이해에 새로운 층위의 복잡성을 더한다. 본 연구는 공간 및 단일 핵 전사체 분석을 사용하여 식물 조직 내 대립유전자 복잡성을 해독하는 프레임워크를 구축하였으며, 포유류 및 Arabidopsis 모델 시스템을 넘어 유전체 각성에 대한 이해를 확장하였다.