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Engineering Thermothelomyces heterothallica for Cellobionate Production

본 연구는 CRISPR-Cas9을 통해 특정 이화 작용 유전자를 결실시켜 고온성 균류인 *Thermothelomyces heterothallica*를 엔지니어링함으로써, 외부 셀룰라아제 없이도 알칼리 전처리된 밀짚을 높은 수율과 전환율로 셀로비오닉산으로 효율적으로 전환하는 균주 TH11을 제작하였다.

원저자: Bakht Zada, Hamidreza Shapouri, Jiajie Wang, Sumit Sharma, Takao Kasuga, Noelia Valbuena, Ronen Tchelet, Mark Emalfarb, Zhiliang Fan

게시일 2026-07-02

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CC BY 4.0

원저자: Bakht Zada, Hamidreza Shapouri, Jiajie Wang, Sumit Sharma, Takao Kasuga, Noelia Valbuena, Ronen Tchelet, Mark Emalfarb, Zhiliang Fan

원본 논문은 CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 라이선스로 제공됩니다. ✨ 이것은 아래 논문에 대한 AI 생성 설명입니다. 저자가 작성하거나 승인한 것이 아닙니다. 기술적 정확성을 위해서는 원본 논문을 참조하세요. 전체 면책 조항 읽기

이 작은, 열을 좋아하는 공장 노동자, Thermothelomyces heterothallica를 상상해 보세요. 이 존재는 단순한 미생물이 아닙니다. 식물 섬유(밀짚 같은)를 먹는 것을 아주 좋아하며, 스스로 그 섬유를 잘라낼 수 있는 특수한 "가위"(효소)를 분비하는 특별한 재능을 가진 미세한 곰팡이입니다.

이 논문의 과학자들은 이 곰팡이에게 새로운 기술을 가르쳐주고 싶었습니다. 식물 섬유를 에너지로 쓰기 위해 단순한 당까지 완전히 다 먹어 치우는 대신, 중간 단계에서 멈추고 식물 부분을 셀로비오닉산(cellobionic acid, 이하 CBA)이라는 가치 있는 화학 물질로 바꾸게 하는 것이 목표였습니다. CBA는 마치 인간에게 훨씬 더 유용한 "절반만 먹은" 초콜릿 바와 같습니다.

과학자들이 이 작업을 수행한 방법은 다음과 같이 간단한 단계로 나뉩니다.

1. 문제점: 공장 노동자가 너무 빨리 먹어 치운다

보통 이 곰팡이는 식물 섬유를 먹을 때, 이를 셀로비오스(cellobiose)라는 당으로 분해한 다음, 곧바로 이를 다시 더 잘게 쪼개서 자신의 성장을 위한 에너지원인 글루코스(glucose)로 만듭니다. 이는 마치 어떤 사람이 택배 상자를 받자마자 상자를 열고, 내용물을 다른 사람이 쓰기도 전에 바로 먹어 치우는 것과 같습니다. 과학자들은 이 곰팡이가 이 "중간 단계"(셀로비오스)를 더 이상 분해하지 못하게 하여, 셀로비오스가 쌓이고 원하는 제품인 CBA로 변하도록 만들고 싶었습니다.

2. 해결책: 유전적 "봉쇄"

이를 해결하기 위해 과학자들은 고도의 편집 도구인 CRISPR-Cas9을 사용하여 곰팡이에 일련의 유전적 "수술"을 수행했습니다. 그들은 곰팡이의 소화 도구 역할을 하는 특정 유전자들을 제거했습니다.

1단계: 셀로비오스를 글루코스로 쪼개는 여덟 가지 서로 다른 "가위"(베타-글루코시다아제)의 유전자를 잘라냈습니다. 이로 인해 곰дя이는 중간 단계를 더 이상 분해할 수 없게 되었습니다.
2단계: 만약 CBA가 만들어지더라도 이를 먹어 치울 수 있는 셀로비오스 인산화효소(cellobiose phosphorylase)라는 기계의 유전자를 제거했습니다. 이를 통해 일단 CBA가 만들어지면 그대로 유지되도록 했습니다.
3단계: 곰팡이가 CBA를 다시 안으로 빨아들여 먹을 수 있게 하는 문(수송체) 역할을 하는 두 개의 유전자를 잘라냈습니다. 이 문들을 차단함으로써, CBA가 곰팡이 외부의 액체 속에 머물도록 강제했습니다.

그 결과, TH11이라 불리는 슈퍼 곰팡이가 탄생했습니다.

3. 과정: 짚을 금으로 바꾸기

과학자들은 이 새로운 TH11 균주에 알칼리 전처리된 밀짚(저렴하고 풍부한 폐기물)을 먹였습니다.

천부적인 재능: TH11은 천연 식물 섭취자이기 때문에, 혼합물에 별도의 효소를 추가할 필요가 없었습니다. 이 균주는 내부의 "가위"를 사용하여 단단한 짚을 셀로비오스로 분해했습니다.
새로운 기술: 유전적 변화 덕분에 곰팡이는 셀로비오스를 먹을 수 없게 되었습니다. 대신, 이 균주는 다른 효소(셀로비오스 탈수소효소)를 사용하여 셀로비오스를 부드럽게 산화시켜 셀로비오닉산으로 변환했습니다.

4. 공장 조건 조율하기

과학자들은 공장이 최고 효율로 돌아가기 위해서는 환경을 미세하게 조정해야 한다는 것을 깨달았습니다.

온도: 이 곰팡이는 열을 좋아합니다. 37°C에서도 작동했지만, 43°C에서 가장 잘 작동했습니다. 이 더 뜨거운 온도에서 "가위"가 더 빠르게 움직였고, 전환 과정이 훨씬 더 빠르게 진행되었습니다.
pH 균형: CBA를 만드는 과정은 액체를 산성(레몬즙을 넣은 것처럼)으로 만듭니다. 과학자들은 환경이 너무 시큼해지는 것을 막기 위해 시트르산 완충제(pH 안정제)를 추가했으며, 이는 곰팡이가 계속 열심히 일할 수 있도록 도와주었습니다.

5. 결과

이 완벽한 조건(43°C 및 pH 완충제) 하에서, TH11 균주는 믿기 힘들 정도로 효율적이었습니다.

속도: 단 5일 만에 높은 양의 CBA를 생산했습니다.
수율: 식물 섬유의 약 **88%**를 제품으로 전환했습니다.
효율성: 실제로 섭취된 식물 섬유 중 **96%**가 성공적으로 CBA로 변환되었습니다.

이것이 왜 중요한가 (논문에 따르면)

이 논문은 이것이 기존 방식보다 큰 개선임을 강조합니다. 이전의 시도들은 다른 곰팡이(Neurospora crassa)를 사용했는데, 이는 8일이 걸렸고 생성되는 제품의 양도 더 적었습니다. 새로운 TH11 균주는 더 빠르고, 더 높은 온도에서 작동하며(이는 원치 않는 박테리아가 자라는 위험을 줄여줍니다), 무엇보다도 비싼 외부 효소를 추가할 필요가 없습니다. 이 균주는 스스로 모든 일을 해내며, 저렴한 밀짚을 직접 가치 있는 화학 물질로 바꿉니다.

요약하자면, 과학자들은 자연 상태의 식물 섭취자를 데려와, 과식하지 못하도록 유전적인 "식단 계획"을 짜주고, 농업 폐기물을 유용한 화학 물질으로 바꾸는 매우 효율적인 기계로 만들기 위해 환경을 조율한 것입니다.

*기술 요약: 셀로비오닉산(Cellobionate) 생산을 위한 Thermothelomyces heterothallica의 공학적 개량*

문제 제식
가치 있는 당산(sugar acid)인 셀로비오닉산(CBA)의 미생물 생산은 현재 높은 원료 비용과 외생 효소에 대한 의존성으로 인해 어려움을 겪고 있다. Neurospora crassa를 활용한 기존 전략은 리그노셀룰로오스 바이오매스로부터의 직접적인 CBA 생산 가능성을 입증했으나, 숙주의 상대적으로 낮은 셀룰라아제 생산 능력과 느린 반응 속도로 인해 한계가 있었다. 또한, 기존 공정은 종종 외부 셀룰라아제 보충을 필요로 하여 운영 비용을 증가시킨다. 따라서 리그노셀룰로오스 바이오매스의 직접적이고 효소가 필요 없는 생물 전환을 촉진하기 위해, 고수준의 천연 효소 분비를 할 수 있는 강력한 호열성 균류 숙주가 필요하다.

방법론
본 연구는 RNP(Ribonucleoprotein) 기반의 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 대사 공학 전략을 사용하여 호열성 사상균인 Thermothelomyces heterothallica(구 Myceliophthora thermophila)를 개량하는 방법을 채택하였다. 이 공학적 접근 방식은 탄소 흐름을 셀룰로오스 분해에서 CBA 축적으로 재지향하는 동시에 제품의 재소모를 방지하는 데 중점을 두었다.

구체적인 유전적 변형은 다음과 같다:

이화 작용 경로 차단: 셀로비오스 및 CBA 이화 작용에 관여하는 유전자들을 순차적으로 결실시켰다. 여기에는 셀로비오스가 포도당으로 가수분해되는 것을 방지하기 위한 8개의 $\beta$ -글루코시다아제(bgl) 유전자 제거, CBA 분해를 차단하기 위한 하나의 셀로비오스/셀로비오네이트 인산화효소(cbp) 유전자 제거, 그리고 CBA 흡수를 방지하기 위한 두 개의 추정 셀로비오네이트 수송체 유전자(cbt1 및 cbt2) 제거가 포함되었다.
균주 구축: 모균주 TH0로부터 연속적인 유전자 결실 과정을 통해 일련의 돌연변이체(TH3, TH6, TH9)를 생성하였다. 최종 균주인 TH11은 총 11개의 유전자 결실을 포함한다.
공정 최적화: pH와 온도를 기준으로 발효 조건을 최적화하였다. 기질로는 알칼리 전처리된 밀짚(2% NaOH)을 사용하였다. 최대 수율과 전환율을 테스트하기 위해 50 mM 시트르산(pH 6.0)으로 완충하고 온도를 변화시켜(37°C, 40°C, 43°C) 실험하였다.
분석: 5일 동안 기질 소비, 생성물 농도, 효소 활성(셀로비오하이드롤라아제[CBH] 및 셀로비오스 탈수소효소[CDH])을 모니터링하였다. 셀룰로오스 전환 및 CBA 수율은 잔류 고형물 및 상등액 분석을 바탕으로 계산되었다.

주요 결과

유전적 검증: 인산화효소 유전자를 결실시킨 TH3 균주는 CBA 이용을 성공적으로 제거하였다. 그러나 중간 단계 균주(TH6, TH6)에서는 잔류 소비로 인해 CBA 축적이 불안정했다. 두 개의 cbt 유전자 결실을 포함한 최종 균주 TH11은 CBA의 재소모를 성공적으로 방지하여 지속적인 축적을 가능하게 했다.
기질 이용: 7중 $\beta$ -글루코시다아제 돌연변이체를 가진 N. crassa가 셀로비오스 이용에 어려움을 겪었던 것과 달리, T. heterothallica 돌연변이체들은 셀로비오스를 효율적으로 이용하였다. 이는 셀로비오스 존재 하에서도 CDH 발현을 허용하는 숙주의 천연 cre-1 돌연변이 덕분인 것으로 나타났다.
생산 성능: 최적 조건(43°C, 50 mM 시트르산 완충액, pH 6.0) 하에서, TH11 균주는 5일 이내에 전처리된 밀짚으로부터 64 mM (약 12.8 g/L)의 CBA를 생산하였다.
전환 효율: 이 공정은 88.0%의 셀룰로오스 전환율과 소비된 셀룰로오스로부터의 96.2% CBA 수율을 달了一种. 자일란 전환율은 95.6%에 달했다.
역학: 호열성 균주는 이전의 엔지니어링된 N. crassa HL10 균주(57 mM에 도달하는 데 8일 소요)에 비해 빠른 생산 역학을 보여주었다. TH11은 더 짧은 시간(5일) 내에 더 높은 농도(64 mM)에 도달했다.
효소 활성: 해당 균주는 CBH와 CDH를 높은 수준으로 자연적으로 분비하였다. CBH 활성은 점진적으로 증가하여 135 U/L에 도달하였고, CDH 활성은 3일째에 441 U/L로 정점에 도달한 후 감소하였다.

의의 및 주장
본 논문은 엔지니어링된 T. heterothallica 균주 TH11이 외부 효소의 첨가 없이 리그노셀룰로오스 바이오매스를 가치 있는 알도닉산(aldonic acids)으로 직접 생물 전환할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공한다고 주장한다. 본 연구의 의의는 다음과 같다:

공정 효율성: 43°C에서 작동하는 호열성 숙주를 사용하여 중간체 시스템에 비해 반응 역학을 가속화하고 오염 위험을 줄인다.
경제적 타당성: T. heterothallica가 높은 수준의 천연 세포외 셀룰라아제(산업적 맥락에서 >100 g/L 용량)를 분비하는 능력은 리그노셀룰로오스 바이오리파이너리에서 주요 비용 장벽인 효소 칵테일 비용을 제거한다.
대사 공학의 성공: 수송체를 포함한 이화 작용 유전자의 순차적 차단이 곰팡이 숙주에서 생성물 농도를 안정화하는 데 결정적임을 입증하였다.

저자들은 전환 효율은 높지만, 셀로비오스의 일시적 축적은 현재 공정이 산화 제한적(oxidation-limited)임을 시사한다고 언급하였다. 그들은 향후 개선이 바이오리액터 내의 산소 공급 강화 및 산화 대사의 추가적인 공학을 통해 이루어질 수 있다고 제안하였으나, 이러한 일반적인 방향 외에 구체적인 새로운 실험 설계는 제시하지 않았다.