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Engineering Thermothelomyces heterothallica for Cellobionate Production

本研究通过 CRISPR-Cas9 技术敲除特定分解代谢基因，对嗜热真菌 *Thermothelomyces heterothallica* 进行了工程化改造，从而构建了菌株 TH11，该菌株能够无需外源纤维素酶即可将碱预处理的小麦秸秆高效转化为纤维二糖酸，并具有高产率和高转化率。

原作者： Bakht Zada, Hamidreza Shapouri, Jiajie Wang, Sumit Sharma, Takao Kasuga, Noelia Valbuena, Ronen Tchelet, Mark Emalfarb, Zhiliang Fan

发布于 2026-07-02

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CC BY 4.0

原作者： Bakht Zada, Hamidreza Shapouri, Jiajie Wang, Sumit Sharma, Takao Kasuga, Noelia Valbuena, Ronen Tchelet, Mark Emalfarb, Zhiliang Fan

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ✨ 这是对下方论文的AI生成解释。它不是由作者撰写或认可的。如需技术准确性，请参阅原始论文。阅读完整免责声明

想象一个微小的、嗜热的工厂工人——Thermothelomyces heterothallica。这不仅仅是一个普通的工人；它是一种微小的真菌，天生喜欢吃坚韧的植物纤维（如麦秆），并且拥有一种特殊的才能，能够分泌它自己的“剪刀”（酶）来将这些纤维切碎。

这篇论文中的科学家们想要教会这种真菌一个新技巧：它不应该把植物纤维一直吃到变成简单的糖为止并用于自身的生长，而是要在中途停止，并将植物部分转化为一种有价值的化学物质——纤维二糖酸（Cellobionic Acid，简称 CBA）。你可以把 CBA 想象成一个“吃了一半”的巧克力棒，对人类来说，这个“半成品”比完整的巧克力棒更有用。

以下是他们是如何实现的，分为简单的步骤：

1. 问题所在：工厂工人吃得太快了

通常情况下，当这种真菌食用植物纤维时，它会将纤维分解成一种叫做纤维二糖（Cellobiose）的糖，然后立即将纤维二糖进一步切碎成葡萄糖（Glucose），以维持自身的生长。这就像一个工人收到包裹，打开包装，然后立即把里面的东西吃掉，导致其他人根本没法使用。科学家们想要阻止真菌吃掉这个“中间步骤”（纤维二糖），让它堆积起来，从而转化成我们想要的产物（CBA）。

2. 解决方案：基因层面的“封锁”

为了解决这个问题，科学家们使用了一种高科技编辑工具（CRISPR-Cas9）对这种真菌进行了系列基因“手术”。他们移除了那些充当真菌消化工具的特定基因。

步骤 1： 他们切除了八种不同“剪刀”（β-葡萄糖苷酶）的基因，这些剪刀通常负责将纤维二糖切碎成葡萄糖。这阻止了真菌将中间步骤进一步分解。
步骤 2： 他们移除了一个名为纤维二糖磷酸化酶（Cellobiose Phosphorylase）的机器基因，这个机器通常会在生产出最终产物（CBA）后将其吃掉。这确保了 de 一旦 CBA 被制造出来，就会留在那里。
步骤 3： 他们切除了两个充当门口（转运体）的基因，这些门口原本允许真菌将 CBA 吸回体内进行食用。通过堵住这些门，CBA 被迫留在外部的液体中。

最终的结果是产生了一种超级真菌，命名为 TH11。

3. 过程：化秸秆为黄金

科学家们给这个新的 TH11 菌株喂食了一些碱处理过的预处理小麦秸秆（一种廉价且丰富的废弃物）。

天然天赋： 由于 TH11 是天然的植物食客，它不需要额外添加任何酶。它利用自带的“剪刀”将坚韧的秸秆分解成纤维二糖。
新技巧： 由于基因改造的原因，该真菌无法食用纤维二糖。相反，它利用另一种酶（纤维二糖脱氢酶）轻轻地氧化纤维二糖，从而将其转化为纤维二糖酸（CBA）。

4. 调节工厂环境

科学家们意识到，为了让工厂运行效率达到顶峰，他们需要调整环境：

温度： 这种真菌热爱热量。虽然它在 37°C 下也能工作，但在 43°C 时表现最好。在更高的温度下，“剪刀”移动得更快，转化过程也更迅速。
pH 值平衡： 制造 CBA 会使液体变酸（就像加入柠檬汁一样）。科学家们添加了一种柠檬酸盐缓冲液（pH 稳定剂）来防止环境变得过酸，这有助于真菌保持高效工作。

5. 结果

在这些完美条件下（43°C 配合 pH 缓冲液），TH11 菌株的表现极其高效：

速度： 它在短短 5 天内就产生了大量的 CBA。
产量： 它将约 88% 的植物纤维转化成了目标产物。
效率： 在实际被消耗的植物纤维中，有 96% 成功转化为了 CBA。

为什么这很重要（根据论文所述）

论文强调，这是一个重大的进步。早期的尝试使用的是另一种真菌（Neurospora crassa），它需要 8 天时间才能产生较少的产物。新的 TH11 菌株不仅速度更快，能在更高的温度下工作（这降低了杂菌生长的风险），而且最重要的是，不需要添加昂贵的外部酶。它能自力更生，直接将廉价的小麦秸秆转化为有价值的化学物质。

简而言之，科学家们拿走了一个天然的植物食客，通过基因手段为它制定了一个“饮食计划”以防止其过度进食，并通过优化环境，使其成为一台将农业废弃物转化为有用化学物质的高效机器。

技术摘要：工程化改造 Thermothelomyces heterothallica 以生产纤维二糖酸

问题陈述
微生物生产纤维二糖酸（CBA）——一种在食品、制药和化学工业中具有广泛应用的增值糖酸——目前受到高成本原料和对外源酶依赖的限制。此前利用 Neurospora crassa 进行的研究证明了从木质纤维素生物质直接生产 CBA 的可行性，但受限于该宿主相对较低的纤维素酶产量和较慢的反应动力学。此外，现有的工艺通常需要添加外部纤维素酶，从而增加了运营成本。因此，需要一种能够高水平分泌原生酶的强健嗜热真菌宿主，以促进木质纤维素生物质向 CBA 的直接、无酶生物转化。

方法论
本研究采用基于核糖核蛋白（RNP）的 CRISPR-Cas9 系统，对嗜热丝状真菌 Thermothelomyces heterothallica（原名 Myceliophthora thermophila）进行代谢工程改造。该工程策略侧重于将碳通量从纤维素降解转向 CBA 的积累，同时防止产物的再消耗。

具体的遗传修饰包括：

阻断分解途径： 序列缺失涉及纤维二糖和 CBA 分解的基因。这包括移除八个 $\beta$ -葡萄糖苷酶基因（bgl）以防止纤维二糖水解为葡萄糖，移除一个纤维二糖/纤维二糖酸磷酸化酶基因（cbp）以阻断 CBA 降解，以及两个推测的纤维二糖酸转运蛋白基因（cbt1 和 cbt2）以防止 CBA 进入细胞。
菌株构建： 从亲本菌株 TH0 出发，通过连续的多轮基因缺失生成了一系列突变体（TH3、TH6、TH9）。最终菌株 TH11 共包含 11 个基因的缺失。
工艺优化： 对发酵条件中的 pH 值和温度进行了优化。研究使用碱处理的小麦秸秆（2% NaOH）作为底物。通过使用 50 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）并测试不同的温度（37°C、40°C、43°C）来最大化产量和转化率。
分析： 在 5 天内监测了底物消耗、产物滴度以及酶活性（纤维素分解酶 [CBH] 和纤维二糖脱氢酶 [CDH]）。根据残留固体和上清液分析计算了纤维素转化率和 CBA 产量。

关键结果

遗传验证： 缺失磷酸化酶基因的菌株 TH3 成功消除了 CBA 的利用。然而，由于存在残余消耗，中间菌株（TH6、TH9）中的 CBA 积累并不稳定。最终菌株 TH11 通过包含两个 cbt 基因的缺失，成功防止了 CBA 的再消耗，从而实现了持续积累。
底物利用： 与难以利用纤维二糖的 N. crassa 七倍 $\beta$ -葡萄糖苷酶突变体不同，T. heterothallica 突变体能高效利用纤维二糖。这归功于该宿主原生的 cre-1 突变，它缓解了碳分解代谢物阻遏作用，使得即使在存在纤维二糖的情况下也能表达 CDH。
生产性能： 在优化条件下（43°C，50 mM 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0），菌株 TH11 在 5 天内从预处理的小麦秸秆中生产了 64 mM（约 12.8 g/L）的 CBA。
转化效率： 该工艺实现了 88.0% 的纤维素转化率 以及 96.2% 的消耗纤维素转化为 CBA 的产量。木聚糖转化率达到了 95.6%。
动力学： 与之前工程化的 N. crassa HL10 菌株（需 8 天达到 57 mM）相比，该嗜热菌株表现出更快的生产动力学。TH11 在更短的时间内（5 天）达到了更高的滴度（64 mM）。
酶活性： 该菌株自然分泌高水平的 CBH 和 CDH。CBH 活性逐步增加，达到 135 U/L；而 CDH 活性在第 3 天达到峰值 441 U/L 后开始下降。

意义与主张
论文声称，工程化改造的 T. heterothallica 菌株 TH11 为直接将木质纤维素生物质转化为增值醛酸提供了一个极具前景的平台，无需添加外部酶。这项工作的意义在于：

工艺效率： 使用在 43°C 下运行的嗜热宿主，与中温系统相比，加速了反应动力学并降低了污染风险。
经济可行性： T. heterothallica 能够分泌高水平的原生纤维素酶（在工业背景下容量 >100 g/L），消除了木质纤维素生物炼制厂中酶鸡尾酒的主要成本障碍。
代谢工程成功： 研究证实，通过连续破坏分解途径基因（包括转运蛋白）对于稳定真菌宿主中的产物滴度至关重要。

作者指出，虽然转化效率很高，但纤维二糖的瞬时积累表明该过程目前受氧化限制。他们建议，未来的改进可以通过增强生物反应器中的氧气供应和进一步工程化氧化代谢来实现，但并未提出除这些一般方向之外的具体新实验设计。