Novel insights on carbon source influence on azomycin production by Streptomyces eurocidicus

기술 요약: Streptomyces eurocidicus의 아조마이신(Azomycin) 생산에 미치는 탄소원의 영향에 관한 새로운 통찰

문제 제기
Streptomyces eurocidicus에 의해 합성되는 이차 대사산물인 아조마이신(2-nitroimidazole)은 약제 내성 결핵, 샤가스병 치료 및 종양 저산소증 영상 진단에 사용되는 중요한 의약품 빌딩 블록이다. 이 물질은 L-아르기닌을 전구체로 하는 생합성 경로가 부분적으로 밝혀졌음에도 불구하고, 최적화된 생산을 위한 바이오프로세스 매개변수는 여전히 상당 부분 미개척 상태로 남아 있다. 통제된 회분식 배양 조건 하에서 S. eurocidicus의 생리, 대사 조절 및 성능에 관한 현대적 데이터는 매우 부족하다. 이러한 특성 규명의 부재는 효율적인 생산 공정 설계를 제한하며, 배지 조성, 특히 탄소와 질소 가용성이 항생제 생합성을 관장하는 조절 기전에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 이해를 제한한다.

연구 방법론
본 연구에서는 다양한 탄소원과 질소원이 아조마이신 수율에 미치는 영향을 평가하기 위해 Streptomyces eurocidicus DSM 40604를 사용하여 일련의 회분식 발효 실험을 수행하였다.

• 배양 시스템: 실험은 계측 기능이 있는 미니 바이오리액터(작동 용량 250 mL)에서 수행되었으며, 이후 3 L 계측 바이오리액터로 스케일업되었다. 배양은 28°C에서 유지되었고, pH는 7.0으로 제어되었으며, 용존 산소(DO)는 약 30%로 유지되었다.
• 배지 조성: 기초 배지를 바탕으로 다양한 탄소원(글루코스, 가용성 전분, 대두유)과 질소원(황산암모늄, 카사미노산)을 변화시켰다. 단일 탄소원, 혼합 기질(예: 글루코스/전분 + 대두유), 그리고 유리 아미노산(카사미노산)이 보충된 조합의 실험이 포함되었다.
• 분석 기술:
  • 생물량 및 기질: 건조 세포 중량(DCW)은 여과 및 건조를 통해 측정하였다. 글루코스는 글루코미터를 사용하여 정량하였고, 전분은 산 가수분해 후 효소 분석을 통해 결정하였으며, 유기 질소(유리 아미노기)는 비색법으로 측정하였고, 트리글리세리드는 상용 효소 키트를 사용하여 분석하였다.
  • 생성물 정량: 아조마이신은 에틸 아세테이트를 이용한 액체-액체 분배법으로 추출되었으며, 다이오드 어레이 검출기가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정량되었다.
  • 동정: 추출된 대사산물의 정체는 양이온 및 음이온 모드 모두에서의 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 통해 확인되었다.
  • 형태학: 세포 형태, 결정 형성 및 세포 내 구조(잠재적인 지질 소포 등)를 관찰하기 위해 주사 전자 현미경(SEM) 및 투과 전자 현미명경(TEM)을 활용하였다.

주요 결과

1. 단계 전환적 생합성: 아조마이신 생산은 후기 단계에서만 성장 연관적(growth-associated)임이 확인되었다. 생합성은 배양 약 72시간째에 시작되었으며, 이는 주요 탄소원(글루코스)의 거의 고갈되는 시점 및 지수 성장기에서 정지기로의 전환 시점과 일치하였다.
2. 탄소원의 영향:
   • 대두유: 대두유는 생물량 축적을 위한 우수한 탄소원 역할을 하였으나(다른 조건보다 약 2배 높은 ~3.5 g/L의 생물량 생성), 아조마이신 생산은 전혀 검출되지 않았다.
   • 글루코스 vs 전분: 유기 질소가 없는 상태에서 전분은 글루코스 단독 조건보다 아조마이신-생물량당 수율이 2.8배 높았다. 그러나 혼합 기질 시나리오에서는 글루코스 기반 배지가 전분 기반 배지보다 우수한 성능을 보였다.
3. 질소원의 영향: 배지에 유리 아미노산(카사미노산)을 보충하는 것이 생산량을 높이는 가장 중요한 요인이었다.
   • 대두유 배지에 카사미노산을 첨가했을 때, 오일 단독 조건보다 생산량이 3배 증가하였으나, 여전히 글루코스에 비해 전체 수율은 억제되었다.
   • 최적의 반정의 배지(semi-defined medium)는 글루코스와 카사미노산의 조합이었다. 미니 바이오리액터에서 이 조성은 46.34 mg/L의 역가(titer)를 달성하였다.
4. 스케일업: 최적화된 글루코스/카사미노산 구성을 3 L 바이오리액터로 스케일업한 결과, 7일 후 최종 아조마이신 농도는 69.18 mg/L에 도달하였다. 이는 미니 바이오리액터 규모에 비해 제품-생물량 수율($Y_{p/x}$)이 89% 증가한 수치이다.
5. 형태학적 관찰: 카사미노산을 포함한 배양물에서는 균사 펠릿(mycelial pellet) 및 상등액 내에서 표준 아조마이신과 형태학적으로 유사한 직사각형 육면체 결정이 형성되었다. TEM 분석 결과 세포질 내에 전자 밀도가 높은 점들이 발견되었으나, 다른 Streptomyces 종에서 일반적으로 나타나는 지질 대사 관련 유조(oil-filled vesicles, 트리아실글리세롤체)는 확인되지 않았다.
6. 대사산물 확인: LC-MS 분석 결과, m/z 114.03에서 [M+H]$^+$ 양이온과 m/z 112.01에서 [M-H]$^-$ 음이온을 검출하여 2-nitroimidazole의 존재를 확인하였으며, 이는 분자식 C$_3$H$_3$N$_3$O$_2$와 일치하였다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 통제된 회분식 배양 하에서 S. eurocidicus의 아조마이신 생산에 대한 최초의 상세한 특성 규명을 제공한다고 주장한다. 주요 기여는 아조마이신 생합성을 활성화하기 위해 탄소원과 질소원의 정밀한 균형이 필수적임을 입증한 데 있다.

구체적으로, 본 논문은 다음을 확립하였다:

• 아조마이신 생합성은 엄격하게 단계 전환적(phase-shifted)이며, 생합성을 유도하기 위해서는 주요 탄소원의 고갈이 필요하다.
• 지질(대두유)은 생물량 축적을 유도할 수 있지만, 다른 Streptomyces 종에서 오일이 생산을 강화하는 것과는 대조적으로, 이 특정 균주에서는 아조마이신 생산을 억제하는 역할을 한다.
• 유리 아미노산(유기 질소)의 가용성은 결정적인 제한 요인이며, 이를 보충함으로써 대사 억제를 극복하고 항생제 수율을 실질적으로 높일 수 있다.
• 최적화된 반정의 배지(글루코스 + 카사미노산)는 산업적 아조마이신 생산을 위한 스케일업 가능하고 효과적인 전략을 제공하며, 이는 3 L 바이오리액터로의 성공적인 스케일업과 상당한 수율 효율 증가를 통해 검증되었다.

본 연구는 이러한 특정 영양 요구 사항을 이해하는 것이 의학적으로 중요한 이 화합물의 효율적인 바이오프로세스를 설계하는 데 필수적이라는 결론을 내린다.