The effect of smoking on microbiome composition of the anterior nares

기술 요약: 흡연이 전비(Anterior Nares) 미생물 군집 구성에 미치는 영향

문제 제기
흡연은 조기 사망 및 이환율의 주요한 전 세계적 위험 요인이며, 호흡기 감염(RTI)에 크게 기여한다. 흡연이 호흡 상피에 미치는 직접적인 독성 효과는 잘 알려져 있으나, 미생물 환경에 미치는 영향에 대해서는 여전히 이해가 부족하다. 기존 연구들은 흡연이 비강 미생물을 변화시켜 혐기성 병원성 분류군(taxa)의 풍부도를 증가시킬 가능성을 시사해 왔다. 그러나 기존 문헌은 작은 표본 크기(흔히 $n < 100$), 불분명한 비교 집단, 그리고 환경적 요인에 가장 직접적으로 노출되는 부위인 전비(anterior nares) 대신 비인두(nasopharyngeal) 샘플링에 의존한다는 한계가 있다. 또한, 이전 연구들은 서로 다른 16S rRNA 가변 영역(V1-V2 대 V4)을 사용하여 분류학적 비교를 제한했다. 본 연구는 흡연 습관과 전비 미생물 군집 사이의 연관성을 규명하기 위해 대규모 일반 인구 기반 표본을 사용하여, 흡연자의 감염 취약성 증가에 대한 기저 메커니즘을 더 잘 이해하고자 한다.

연구 방법론
본 연구는 독일 국가 코호트(NAKO) 데이터를 활용하였으며, 특히 완전한 생체 물질 세트(대변, 구강, 비강)를 보유한 참가자 2,400명을 무작위로 추출하였다. 흡연 상태 및 교란 변수에 대한 결측치를 필터링한 후, 최종 분석에는 1,948명의 참가자(비흡연자 47.6%, 과거 흡연자 35.6%, 현재 흡연자 16.8%)가 포함되었다.

• 샘플링 및 시퀀싱: 전비를 대상으로 콧구멍 안쪽 1–1.5 cm까지 스왑(swab)을 삽슐하여 샘플을 채취하고, RNAlater에 보관한 후 DNA 분리를 진행하였다. 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 Illumina MiSeq(2x 300 bp)을 사용하여 V3-V4 가변 영역을 타겟팅하였다.
• 생물정보학: USE-ARCH 파이프라인(v11.9.667)을 사용하여 리드(reads)를 제로-반경 운영 분류 단위(zOTU)로 처리하였다. 분류학적 할당은 GreenGenes2 데이터베이스를 사용하였다.
• 통계 분석:
  • 알파 다양성(Alpha Diversity): 선형 회귀 모델을 사용하여 흡연 상태(비흡연, 현재 흡연, 과거 흡연)와 5가지 다양성 지표(Observed richness, Chao1, Shannon, Inverse Simpson, Faith's PD) 간의 연관성을 평가하였으며, 연령, 성별, 계절, 사회경제적 지위(SES) 및 시퀀싱 깊이를 보정하였다.
  • 베타 다양성(Beta Diversity): Aitchison, Bray-Curtis, UniFrac 거리를 사용한 PERMANOVA(Adonis2)를 통해 흡연 상태가 설명하는 미생물 군집의 분산을 평가하였다.
  • 차등 풍부도(Differential Abundance): 견고성을 확보하기 위해 세 가지 방법을 사용하였다: 쌍별 윌콕슨 순위 합 검정(pairwise Wilcoxon rank sum tests), MaAsLin3(선형 모델), 그리고 랜덤 포레스트(Random Forest) 모델. 세 가지 방법 모두에서 식별된 분류군만을 차등 풍부한 것으로 간주하였다.
  • 토픽 모델링(Topic Modeling): 생물학적 기능을 공유하는 속(genera) 그룹을 식별하기 위해 잠재 디리클레 할당(LDA)을 사용하였으며, 토픽 분포를 흡연 상태별로 비교하였다.
  • 민감도 분석: 호흡기 질환(천식/COPD)을 보정하고, 독일 태생 참가자로 제한하며, 최근 항생제 사용자를 제외하여 분석을 반복하였다.

주요 결과

• 미생물 구성: 가장 우세한 속은 Corynebacterium(100%), Staphylococcus(100%), Cutibacterium(99.9%)이었다.
• 알파 다양성: 현재 흡연자는 비흡연자에 비해 미생물 다양성이 유의미하게 높았으며, 특히 Shannon 지수(Cohen's $d = 0.20$)와 Inverse Simpson 지수(Cohen's $d = 0.23$)에서 그러하였다. 평생 흡연량과 다양성 사이, 또는 과거 흡연 상태와 다양성 사이에는 유의미한 연관성이 발견되지 않았다.
• 베타 다양성: 흡연 상태는 미생물 군집 분산의 적지만 통계적으로 유의미한 부분(다양한 거리 지표에 걸쳐 0.4% ~ 1.1%)을 설명하였다.
• 차등 풍부도: 세 가지 분석 방법 모두에서 차등 풍부하게 식별된 7개의 분류군이 확인되었다. 현재 흡연자는 혐기성 병원성 미생물, 특히 Anaerococcus, Finegoldia, Peptoniphilus의 상대적 풍부도가 높았다. 반대로, Lawsonella, Neisseria(563205), Campylobacter(b)는 변화된 풍부도를 보였다(즉, Neisseria와 Lawsonella는 낮아졌고, Campylobacter는 높아졌다).
• 과거 흡연자: 과거 흡연자들은 부분적인 정상화 패턴을 보였는데, 현재 흡연자와 비교했을 때 Anaerococcus, Peptoniphilus, Finegoldia에 대해 유사하지만 더 약한 방향성의 연관성을 나타냈다.
• LDA 클러스터링: 6개의 토픽이 식별되었다. 현재 흡연자는 비흡연자에 비해 "Peptoniphilus/Anaerococcus" 토픽의 비율이 유의미하게 높았다.
• 용량-반응 관계(Dose-Response): 특정 분류군 풍부도나 다양성 지표와 평생 흡연량 사이의 유의미한 용량-반응 관계는 관찰되지 않았으며, 이는 흡연의 양보다는 흡연 행위 자체가 미생물 변화를 유도함을 시사한다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 대규모 코호트($N=1,948$)를 사용하여 흡연과 전비 미생물 군집 사이의 연관성을 종합적으로 평가한 최초의 독일 인구 기반 연구라고 주장한다. 본 연구의 주요 기여는 높은 미생물 다양성과 특정 혐기성 병원성 미생물(Anaerococcus, Finegoldia, Peptoniphilus)의 농축을 견고하게 식별한 것이다.

본 논문은 이러한 결과가 담배 연기가 전비 내 산소 농도를 변화시켜, Neisseria와 같은 호기성 공생균보다 혐기성 분류군의 성장을 선호하는 환경을 조성한다는 가설과 일치한다고 상정한다. 이러한 변화는 흡연자의 호흡기 감염 취약성 증가와 연결된다. 또한, 과거 흡연자에게서 관찰된 부분적 정상화는 금연이 미생물 프로파일을 비흡연자에 더 가까운 상태로 복구시켜 감염 위험을 줄일 수 있음을 시사한다. 저자들은 본 연구가 단면 연구(cross-sectional)로서 인과관관계를 확립할 수는 없지만, 대규모 표본 크기와 엄격한 다중 방법론적 접근을 통해 이전의 소규모 연구들보다 이 연관성을 더 신뢰할 수 있게 특징지었다는 점을 강조한다.