Actin Polymerization Is Required for Macrophage Uptake of Tattoo Pigments In Vitro and In Vivo

기술 요약: 액틴 중합은 체외 및 체내 대식세포의 타투 색소 섭취에 필수적임

문제 제기
타투가 널리 보급되어 있음에도 불구하고, 타투 색소의 내부화 및 지속을 조절하는 구체적인 세포 기제는 여전히 명확히 정의되지 않은 상태로 남아 있다. 피부 대식세포가 타투 색소의 주요 세포 저장소로서 색소 포획, 세포 회전, 방출 및 재포획의 순환을 통해 타투의 안정성을 유지한다는 점은 확립되어 있으나, 이러한 섭취에 필요한 세포 내 기구는 완전히 규명되지 않았다. 타투 색소의 물리화학적 이질성(5~500 nm 범위)과 대식세포의 식세포 작용 특성을 고려할 때, 섭취는 액틴 의존적인 과정인 phagocytosis(식작용) 또는 macropinocytosis(거대음세포작용)와 같은 능동적인 과정을 포함할 것이라는 가설이 제기된다. 그러나 다양한 타투 색소와 액틴 중합을 연결하는 직접적인 실험적 증거는 그동안 부족했다.

방법론
본 연구는 두 가지 화학적으로 구별되는 상업용 타투 잉크인 탄소 기반 블랙 잉크(CI-77266)와 성분이 공개되지 않은 형광 그린 잉크의 섭취를 조사하기 위해 in vitro(체외) 및 in vivo(체내) 모델을 결합한 다각적 접근 방식을 채택하였다.

• 특성 분석: 잉크의 특성을 분석하기 위해 라만 분광법(탄소 성분 확인), 나노입자 추적 분석(NTA, 크기 분포 및 농도 측정), 그리고 형광 특성을 위한 스펙트럼 분석을 사용하였다.
• In Vitro 모델: 인간 THP-1 단핵구를 PMA를 사용하여 대식세포 유사 세포로 분화시켰다. 섭취 분석은 유세포 분석법, 공초점 현미경, 투과 전자 현미경(TEM), 그리고 블랙 잉크를 위한 새로운 흡광도 기반 정량 분석법을 사용하여 수행되었다.
  • 온도 민감성: 수동적인 표면 부착과 능동적인 내부화를 구분하기 위해 세포를 4°C와 37°C에서 각각 배양하였다.
  • 약리학적 억제: 액틴 중합을 방해하기 위해 Cytochalasin D (2 µM)를, macropinocytosis를 억제하기 위해 EIPA (100 µM)를 전처리하였다.
  • 대조군: Trypan blue 퀴칭(quenching)을 사용하여 형광 신호가 세포 내부에 위치함을 확인하였다. Phalloidin 염색을 통해 액틴 세포골격의 파괴를 검증하였다.
• In Vivo 모델: 대식세포가 형광으로 표지된 제브라피쉬 모델(Tg(mpeg1.1:Loxp-DsREDx-Loxp-EGFP))을 활용하였다. 제브라피쉬 유생(수정 후 6일)에 형광 그린 색소를 몸통 근육에 미세 주입하기 전 Cytochalasin D (0.4 µM)를 처리하였다. 색소 섭취 및 대식세포 모집은 주입 3시간 후 공초점 현미경을 통해 평가되었다.
• 각질세포 평가: 비대식세포 섭취 기여도를 평가하기 위해 HaCaT 각질세포주를 테스트하였다.

주요 결과

1. 능동적, 온도 의존적 내부화: THP-1 유래 대식세포에 의한 형광 그린 및 블랙 타투 잉크의 섭취는 37°C에 비해 4°C에서 현저히 감소하였다. Trypan blue 퀴칭과 직교 공초점 관찰을 통해 37°C에서 남은 신호가 표면 부착이 아닌 내부화된 색소임을 확인하였다.
2. 액틴 중합의 필요성: Cytochalasin D 전처리는 그린 및 블랙 잉크 모두의 섭취를 유의하게 감소시켰다.
   • 유세포 분석: 잉크 양성 세포의 비율과 평균 형광 강도(MFI)가 유의하게 감소함을 보여주었다.
   • 현미경 관찰: 공초점 및 TEM 이미지는 대조군 세포에는 세포 내 색소 소낭이 존재하는 반면, Cytochalasin D 처리된 세포는 조직화되지 않은 액틴 네트워크와 세포 내 색소의 결핍을 보였으며, 잔류 신호는 세포 주변부에 국한되어 있음을 나타냈다.
   • 정량화: 흡광도 기반 분석을 통해 Cytochalasin D 처리된 대식세포에서 블랙 잉크 섭취가 유의하게 감소함을 확인하였다.
3. In Vivo 검증: 제브라피쉬 유생에서 Cytochalasin D 처리는 주입 부위로의 대식세포 모집을 막지는 않았으나, 색소를 함유한 대식세포의 비율을 유의하게 감소시켰으며, 이는 in vivo에서도 섭취를 위해 액틴 중합이 필요함을 확인시켜 주었다.
4. 각질세포의 기여: HaCaT 각질세포는 타투 색소의 내부화가 미미하였으며, 신호가 주로 세포막에 국한되었고 액틴 교란의 영향을 받지 않았다. 이는 해당 조건 하에서 대식세포가 섭취의 주요 동력임을 시사한다.
5. 경로 특이성: Macropinocytosis 억제제인 EIPA는 섭취를 부분적으로 감소시켰으나, 그 효과는 Cytochalasin D보다 약했으며 덜 특이적이었다. 데이터는 액틴 의존적 기제를 지지하지만, phagocytosis와 macropinocytosis 중 어느 하나가 독점적인 경로인지 명확히 구분하지는 못한다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 상업용 타투 색소의 대식세포 섭취가 액틴 중합에 의존한다는 첫 번째 직접적인 실험적 증거를 제공한다고 주장한다. 이 결과는 타투 잉크의 입자적 특성과 대식세포 생물학 사이의 기계적 연결을 확립하며, 탄소 기반 블랙 및 형광 그린 색소 모두에 대해 액틴 구동 내부화가 공통된 요구 사항임을 규명한다.

본 연구는 액틴 중합이 핵심적인 요구 사항임을 식별했으나, 단일한 특정 내부화 경로(예: phagocytosis와 macropinocytosis를 명확히 구분하는 것)를 할당하지는 못했다고 겸허히 결론짓는다. 저자들은 이러한 발견이 타투 색소의 지속성에 기여하는 세포 과정을 이해하는 데 기초적인 이해를 제공한다고 상정한다. 또한, 이러한 기제를 밝히는 것이 향후 타투 제거 전략을 고안하고, 지속적인 환경 나노입자와 면역 세포 간의 상호작용에 대한 이해를 높이는 데 기여할 수 있다고 제안하며, 즉각적인 임상 적용이나 특정 독점 기술의 검증을 주장하지는 않는다.