Integrated bioprocess development for laccase production by an endophytic Trametes villosa isolated from cocoa agro-industrial waste

*기술 요약: 코코아 농산업 폐기물 유래 내생균 Trametes villosa의 라카아제 생산을 위한 통합 바이오프로세스 개발*

문제 제기
코코아(Theobroma cacao L.) 가공 과정에서는 과실 질량의 70~80%에 달하는 상당한 양의 농산업 폐기물이 발생하며, 이는 풍부한 리그노셀룰로오스 및 생리활성 성분에도 불구하고 흔히 버려지곤 한다. 내생 균류는 생명공학적으로 유용한 효소의 유망한 원천으로 알려져 있으나, 미개척 분야인 코코아 잔사로부터 라카아제 생산 균주를 분리하는 연구는 매우 부족한 실정이다. 기존 문헌에 따르면 코코아 조직에서 내생 균류를 탐색한 연구는 극히 제한적이며, 라카아제 생산을 보고한 사례는 매우 적다. 따라서 순환 바이오경제의 틀 안에서 이 저가치 바이오매스를 고가치의 생물촉매로 가치화할 필요가 있다.

방법론
본 연구는 다섯 단계의 연속적인 과정을 포함하는 통합 바이오프로스스 접근법을 채택하였다:

1. 미생물 생물탐사(Microbial Bioprospecting): 코코아 농산업 폐기물의 껍질, 줄기, 잎에서 내생 균류를 분리하였다. 표면 멸균 후, 젠타마이신이 첨가된 감자 데크스트로스 한천 배지(PDA)에 접종하였다. 총 25종의 미생물을 분리하였으며, 가장 높은 라카아제 활성을 보인 균주(CC4)를 ITS rDNA 시퀀싱을 통해 Trametes villosa로 동정하였다.
2. 통계적 최적화: CC4 균주의 라카아제 생산을 최적화하기 위해 중심 합성 회전 설계(CCRD)를 사용하였다. 독립 변수는 pH(범위 3.3–8.8)와 온도(범위 20.5–37.5 °C)였다. 반응 변수는 비라카아제 활성(µmol/mg min)이었다.
3. 생산 역학 모델링: 최적 조건 하에서 9일 동안 라카아제 생산 역학을 모니터링하였다. 데이터는 MATLAB을 사용하여 로지스틱(Logistic) 모델과 곰페르츠(Gompertz) 모델에 적합(fitting)시켰으며, 이를 통해 생산 프로파일을 결정하기 위한 최적의 예측 방정식을 도출하였다.
4. 촉매 역학 모델링: 라카아제가 농축된 추출물에 의한 시링갈다진(syringaldazine) 산화를 상미분 방정식(ODEs) 시스템을 사용하여 모델링하였다(효소 촉매 반응 E + S ↔ ES → P + E에 대한 질량 수지 기반). 이 접근법을 통해 역학 상수($k_1, k_{-1}, k_2$)를 추정하고 $K_M$ 및 $V_{max}$를 계산하였다.
5. 고정화 및 적용: 라카아제 농축 추출물을 글루타르알데히드로 활성화된 키토산에 고정하였다. 생성된 생물촉매를 35 °C, pH 6.0 조건에서 ABTS를 산화환원 매개체로 사용하여 Remazol Brilliant Blue R (RBBR) 및 Bromophenol Blue (BPB)의 탈색 성능을 테스트하였다. 안정성과 재사용성은 3회 연속 사이클에 대해 평가되었다.

주요 결과

• 분리 및 동정: Trametes villosa로 동정된 CC4 균주는 분리된 25개 균주 중 가장 높은 라카아제 생산 능력을 나타냈다. 이는 코코아 농산업 폐기물에서 내생균으로서 T. villosa를 분리하여 보고한 첫 사례이다.
• 공정 최적화: 통계적 분석 결과, 라카아제 생산은 배양 조건에 크게 의존하는 것으로 나타났다. 최적 조건은 pH 5.4 및 28 °C로 결정되었다. 이러한 조건에서 비라카아제 활성은 5일간의 배양 후 최대 171.48 µmol/mg min에 도달하였다. 이차 모델의 결정 계수는 높은 수준($R^2 = 0.9364$)을 보였다.
• 생산 역학: 생산 프로파일은 시그모이드 곡선을 따랐다. 로지스틱 모델이 곰페르츠 모델($R^2 = 0.9839$)보다 우수한 적합도($R^2 = 0.9871$)를 보였으며, 라카아제 생합성의 성장 관련 특성을 정확하게 설명하였다.
• 촉매 역학: ODE 기반 모델은 시링갈다진의 실험적 산화 프로파일을 성공적으로 재현하였다. 계산된 역학 파라미터는 $V_{max} = 284.65$ µmol/L min 및 $K_M = 67.38$ µmol/L였으며, 이는 중간 정도의 기질 친화도와 높은 촉매 능력을 나타낸다.
• 염료 분해:
  • 유리 효소(Free Enzyme): 첫 번째 사이클에서 RBBR에 대해 82.66%의 탈색을 달성했으나, BPB에 대해서는 0.15%에 그쳤다.
  • 고정화 효소(Immobilized Enzyme): 첫 번째 사이클에서 RBBR에 대해 100% 탈색 및 BPB에 대해 99.9% 탈색을 달성하였다.
  • 재사용성: 고정화된 생물촉매는 3회의 연속 사이클 동안 높은 성능을 유지하였으며, 세 번째 사이클까지 RBBR에 대해 85.18%, BPB에 대해 98.79%의 활성을 유지하였다.

의의 및 주장
본 논문은 미생물 자원 탐사와 환경 생명공학을 연결하는 통합 전략을 제시한다고 주장한다. 본 연구의 주요 의의는 코코아 농산업 폐기물이 고가치의 산업용 생물촉매를 위한 지속 가능한 저장소 역할을 할 수 있음을 입증한 데 있다. 구체적으로, 본 연구는 다음을 수행하였다:

1. Trametes villosa의 알려진 출처를 확장하여, 이를 단순한 목재 분해자가 아닌 코코아 잔사 유래 내생균으로 식별하였다.
2. 저가치 농업 폐기물을 폐수 처리를 위한 기능적 생물촉매로 전환함으로써 순환 바이오경제 접근법을 검증하였다.
3. 고정화의 효능을 입증하여, 키토산에 고정된 라카아제가 특히 BPB와 같은 난분해성 염료에 대해 유리 효소보다 탈색 효율과 운전 안정성을 크게 향상시킨다는 것을 보여주었다.
4. 생산 역학(로지스틱 모델)과 반응 역학(ODE 시스템)을 모두 사용하여 바이오프로스를 예측하고 최적화할 수 있는 강력한 모델링 프레임워크를 제공하였다.

저자들은 생물탐사, 통계적 최적화, 역학 모델링 및 고정화를 포괄하는 이 통합 프레임워크가 지속 가능한 바이오프로세스 공학 원칙에 부합하는 지속 가능한 효소 공정을 개발하기 위한 실행 가능한 경로를 제공한다고 결론지었다.