Integrated bioprocess development for laccase production by an endophytic Trametes villosa isolated from cocoa agro-industrial waste

Resumo Técnico: Desenvolvimento de Bioprocesso Integrado para a Produção de Lacase por Trametes villosa Endofítica a partir de Resíduos Agroindustriais de Cacau

Problema
O processamento de cacau (Theobroma cacao L.) gera um volume substancial de resíduos agroindustriais, estimado em 70–80% da massa do fruto, que é frequentemente descartado, apesar de sua rica composição lignocelulósica e bioativa. Embora fungos endofíticos sejam reconhecidos como fontes promissoras de enzimas de relevância biotecnológica, há uma escassez de pesquisas focadas no isolamento de linhagens produtoras de lacase a partir de resíduos de cacau subexplorados. A literatura anterior indica que apenas um número limitado de estudos explorou fungos endofíticos de tecidos de cacau, com pouquíssimos relatando a produção de lacase. Consequentemente, há uma necessidade de valorizar essa biomassa de baixo valor em biocatalisadores de alto valor dentro do framework da bioeconomia circular.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem de bioprocesso integrado compreendendo cinco estágios sequenciais:

1. Bioprospecção Microbiana: Fungos endofíticos foram isolados de cascas, caules e folhas de resíduos agroindustriais de cacau. A esterilização de superfície foi seguida pela inoculação em Ágar Batata e Dextrose (PDA) suplementado com gentamicina. Vinte e cinco microrganismos foram isolados, e a linhagem com a maior atividade de lacase (CC4) foi identificada via sequenciamento de rDNA ITS como Trametes villosa.
2. Otimização Estatística: Um Design de Rotação de Composto Central (CCRD) foi utilizado para otimizar a produção de lacase pela linhagem CC4. As variáveis independentes foram pH (faixa de 3,3–8,8) e temperatura (faixa de 20,5–37,5 °C). A variável resposta foi a atividade específica da lacase (µmol/mg min).
3. Modelagem Cinética da Produção: A cinética de produção de lacase foi monitorada ao longo de 9 dias sob condições ótimas. Os dados foram ajustados aos modelos Logístico e de Gompertz utilizando MATLAB para determinar a melhor equação preditiva para o perfil de produção.
4. Modelagem Cinética da Catálise: A oxidação de seringaldazina pelo extrato enriquecido com lacase foi modelada usando um sistema de equações diferenciais ordinárias (ODEs) baseado em balanços de massa para uma reação catalisada por enzima (E + S ↔ ES → P + E). Esta abordagem permitiu a estimativa das constantes cinéticas ($k_1, k_{-1}, k_2$) e o cálculo de $K_M$ e $V_{max}$.
5. Imobilização e Aplicação: O extrato enriquecido com lacase foi imobilizado em quitosana ativada por glutaraldeído. O biocatalisador resultante foi testado para a descoloração de Remazol Brilliant Blue R (RBBR) e Bromofenol Blue (BPB) a 35 °C e pH 6,0, utilizando ABTS como mediador redox. A estabilidade e a reusabilidade foram avaliadas ao longo de três ciclos consecutivos.

Principais Resultados

• Isolamento e Identificação: A linhagem CC4, identificada como Trametes villosa, exibiu a maior capacidade de produção de lacase entre os 25 isolados. Isso representa o primeiro relato de T. villosa isolada como endófita de resíduos agroindustriais de cacau.
• Otimização do Processo: A análise estatística revelou que a produção de lacase é altamente dependente das condições de cultivo. As condições ótimas foram determinadas como pH 5,4 e 28 °C. Sob estas condições, a atividade específica da lacase atingiu um máximo de 171,48 µmol/mg min após cinco dias de cultivo. O modelo quadrático apresentou um alto coeficiente de determinação ($R^2 = 0,9364$).
• Cinética de Produção: O perfil de produção seguiu uma curva sigmoide. O modelo Logístico proporcionou um ajuste superior ($R^2 = 0,9871$) em comparação ao modelo de Gompertz ($R^2 = 0,9839$), descrevendo com precisão a natureza associada ao crescimento da biossíntese de lacase.
• Cinética Catalítica: O modelo baseado em ODEs reproduziu com sucesso os perfis de oxidação de seringaldazina. Os parâmetros cinéticos calculados foram $V_{max} = 284,65$ µmol/L min e $K_M = 67,38$ µmol/L, indicando afinidade moderada pelo substrato e alta capacidade catalítica.
• Degradação de Corantes:
  • Enzima Livre: Alcançou 82,66% de descoloração de RBBR, mas apenas 0,15% para BPB no primeiro ciclo.
  • Enzima Imobilizada: Alcançou 100% de descoloração de RBBR e 99,9% de descoloração de BPB no primeiro ciclo.
  • Reusabilidade: O biocatalisador imobilizado manteve alto desempenho ao longo de três ciclos, retendo 85,18% de atividade para RBBR e 98,79% para BPB no terceiro ciclo.

Significância e Alegações
O artigo alega apresentar uma estratégia integrada que conecta a exploração de recursos microbianos com a biotecnologia ambiental. Sua principal significância reside em demonstrar que o resíduo agroindustrial do cacau serve como um reservatório sustentável para biocatalisadores industriais de alto valor. Especificamente, o estudo:

1. Expande as fontes conhecidas de Trametes villosa, identificando-a como um endófito em resíduos de cacau, em vez de apenas um decompositor de madeira.
2. Valida uma abordagem de bioeconomia circular ao converter resíduos agrícolas de baixo valor em um biocatalisador funcional para o tratamento de águas residuais.
3. Demonstra a eficácia da imobilização, mostrando que a lacase imobilizada em quitosana aumenta significativamente a eficiência de descoloração e a estabilidade operacional em comparação com a enzima livre, particularmente para corantes recalcitrantes como o BPB.
4. Fornece um framework de modelagem robusto usando tanto a cinética de produção (modelo Logístico) quanto a cinética de reação (sistema de ODEs) para prever e otimizar o bioprocesso.

Os autores concluem que este framework integrado — abrangendo bioprospecção, otimização estatística, modelagem cinética e imobilização — oferece um caminho viável para o desenvolvimento de processos enzimáticos sustentáveis alinhados com os princípios da engenharia de bioprocessos sustentáveis.