Catalytic-subunit-selective transcriptional regulation of the proteasome by E4F1

기술 요약: E4F1에 의한 촉매 하위 단위 선택적 전사 조절

문제 제기
유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 세포 단백질 항상성 유지에 필수적이지만, 프로테아좀 생성을 조절하는 전사 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 전사 인자 Nrf1은 프로테아좀 기능 저하에 반응하여 프로테아좀 하위 단위 유전자들을 유도하는 조정자로 잘 알려져 있으나, 기존의 관점은 프로테아좀 유전자 발현이 주로 통합된 전사 프로그램(coordinated transcriptional programs)을 통해 일어난다고 시사한다. 그러나 최근 THAP1이 Nrf1과는 독립적으로 촉매 $\beta$5 하위 단위 유전자(PSMB5)를 선택적으로 조절한다는 사실이 밝혀지면서, 통합된 전사가 유일한 메커니즘이 아닐 수 있음이 시사되었다. 다른 개별 촉매 하위 단위들을 조절하는 구체적인 메커니즘과, 서로 다른 전사 인자들이 특정 촉매 하위 단위를 선택적으로 표적할 수 있는지 여부는 그동안 알려지지 않았다.

연구 방법론
저자들은 새로운 프로테아좀 생성 조절 인자를 식별하고 특성화하기 위해 다각적인 접근 방식을 채택하였다:

• 전전체 CRISPRi 스크리닝: 형광 프로테아좀 활성 리포터(mCherry-P2A-ZsGreen-mODC)를 HEK293T 세포에서 전전체 CRISPR 간섭(CRISPRi) 플랫폼에 적합하도록 변형하였다. 프로테아좀 기능 장애를 나타내는 ZsGreen 형광이 증가한 세포들을 선별하여 차세대 염기서열 분석을 수행함으로써 후보 조절 유전자를 식별하였다.
• 검증 및 기능 분석: 독립적인 sgRNA를 사용하여 HEK293T, U2OS, HCT116 세포에서 후보 유전자들의 넉다운(knockdown) 효과를 검증하였다. 프로테아좀 기능은 유세포 분석(26S와 20S 활성을 구분하기 위한 SDS 처리 전후 비교), 키모트립신 유사 펩티다제 활성 측정, 그리고 유비퀴틴화된 단백질 및 프로테아좀 하위 단위에 대한 면역 블로팅을 통해 평가되었다.
• 조립 분석: 글리세롤 구배 원심분리법을 사용하여 세포 용해물을 분획하고, 프로테아좀 조립 중간체, 특히 $\beta$ 하위 단위의 결합 및 전구체 축적을 모니터링하였다.
• 전사체 분석: 프로테아좀 기능 장애에 따른 이차적 효과와 구분하기 위해, 결핍(knockout) 초기 시점에서의 RT-qPCR 및 RNA-seq을 수행하여 일차적 전사 표적을 식별하였다.
• 구조 실험(Rescue Experiments): 개별 FLAG 태그가 붙은 $\beta$1–$\beta$7 하위 단위를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 사용하여, E4F1 결핍으로 인한 결함을 회복시키는 데 어떤 특정 하위 단위 보충이 필요한지 결정하였다.
• 기전 연구: 공개된 ChIP-seq 데이터셋을 분석한 후, 프로모터 결실을 이용한 루시페레이즈 리포터 분석과 E4F1이 PSMB6 프로모터에 직접 결합하는지를 확인하기 위한 염색질 면역침전(ChIP)-qPCR을 수행하였다.
• 비교 분석: E4F1 결핍 세포의 전사 프로파일을 이전에 발표된 THAP1 결핍 세포의 데이터와 비교하여, 미토콘드리아 유전자를 포함한 중첩되거나 구별되는 표적 유전자 세트를 확인하였다.

주요 결과

1. E4F1의 식별: CRISPRi 스크리닝 결과, 전사 인자 E4F1이 강력한 히트(hit)로 식별되었다. E4F1 결핍은 프로테아좀 리포터의 현저한 축적, 펩티다제 활성 감소, 그리고 유비퀴틴화된 단백질의 축적을 초래하였다.
2. PSMB6의 선택적 조절: 모든 프로테아좀 하위 단위 유전자 중에서, E4F1 결핍은 촉매 $\beta$1 하위 단위(PSMB6)의 mRNA 및 단백질 수준을 선택적으로 감소시켰다. 다른 $\beta$ 하위 단위, $\alpha$ 하위 단위, 조절 입자 하위 단위 및 조립 샤페론들은 거의 변화가 없었다.
3. 조립에 미치는 영향: E4F1 결핍은 20S 코어 입자(CP) 조립을 저해하였다. 글리세롤 구배 분석 결과, $\beta$2 및 $\beta$5의 전구체 형태를 포함하는 조립 중간체가 축적되었으며, 성숙한 $\beta$1은 부재하였다. 이는 $\beta$5 결합 이후에는 진행되지만 완료되기 전 단계에서 조립이 정체됨을 나타낸다.
4. $\beta$1 복구를 통한 인과관계 증명: E4F1 결핍 세포에 $\beta$1 하위 단위를 재발현시키는 것만으로도 프로테아좀 활성을 회복시키고, 성숙한 CP 수준을 복구하며, 조립 중간체를 해결하고, 유비퀴틴화된 단백질 축적을 줄이는 데 충분하였다. 이는 조립 결함이 주로 PSMB6 발현 손실에 의해 유도되었음을 확인시켜 준다.
5. 직접적인 전사 조절: E4F1은 PSMB6 프로모터 영역에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 가설적인 E4F1 결합 모티프를 삭제했을 때 프로모터 활성이 유의하게 감소하였으며, ChIP-qPCR을 통해 야생형 E4F1은 DNA 결합 도메인 돌연변이체와 달리 PSMB6 프로모터와 결합함을 확인하였다.
6. 구별되는 전사 프로그램: E4F1과 THAP1 모두 특정 촉매 하위 단위(PSMB6 및 PSMB5)와 미토콘드리아 유전자 세트를 조절하지만, 이들의 전사 표적은 서로 거의 중첩되지 않는다. $\beta$1 또는 $\beta$5를 복구하는 것이 각각 E4F1 또는 THAP1 결핍에 의한 미토콘드리아 유전자 발현 결함을 회복시키지 못했다는 점은, 이들 전사 인자가 프로테아좀 하위 단위와 미토콘드리아 유전자를 독립적인 메커니즘을 통해 조절함을 시사한다.
7. 보존성: E4F1에 의한 PSMB6 및 관련 미토콘드리아 유전자의 선택적 조절은 다양한 세포 유형(SH-SYNF, U2OS, MEFs)과 생체 내 모델(마우스 정자 형성 세포)에서도 관찰되었으며, 이는 THAP1 경로의 Thap1 돌연변이 마우스 모델에서도 확인되었다.

의의 및 주장
본 논문은 촉매 하위 단위 선택적 전사 조절이라는, 이전에 인식되지 않았던 프로테아좀 유전자 조절의 새로운 층위를 확립하였다. 저자들은 개별 촉매 프로테아좀 하위 단위가 Nrf1 매개 반응과 같은 통합된 프로테아좀 전반의 전사 프로그램에 의해서만 조절되는 것이 아니라, 별도의 전사 인자에 의해 독립적으로 조절될 수 있다고 주장한다.

구체적으로, 본 연구는 E4F1이 PSMB6 ($\beta$1)의 직접적인 전사 조절자임을 밝혔으며, 이전 연구에서 보여준 THAP1과 PSMB5 ($\beta$5)의 관계와 더불어, 서로 다른 전사 인자들이 특정 촉매 하위 단위를 미세 조정한다는 모델을 제시한다. 이러한 메커니즘은 세포가 특정 생리적 요구 또는 환경 조건에 맞춰 프로테아좀 용량을 적응할 수 있게 할 것이다. 나아가, E4F1 및 THAP1과 같은 전사 인자의 병원성 변이가 알려진 표적뿐만 아니라 특정 프로테아좀 촉매 하위 단위의 조절 장애를 통해서도 인간 질병(미토콘드리아 질환 및 디스토니아 등)에 기여할 수 있음을 시사한다. 이 연구는 통합된 유도 모델을 넘어 프로테아좀 전사 조절의 개념적 틀을 확장한다.