Interval-zone free-flow electrophoresis as a charge-specific dimension for native isolation of thylakoid membrane protein complexes
본 연구는 간격 구역 자유 흐름 전기영동(iZE)이 틸라코이드 막 단백질 복합체의 천연 상태 분리를 위한 효과적인 전하 기반 직교 차원으로서, 전통적인 크기 기반 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 비해 ATP 합성효소, PSII, PSI와 같은 뚜렷한 조립체들을 더 우수한 해상도로 분리해 낸다는 것을 입증한다.
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식물 잎의 작은 초록색 공장 내부에서는 태양광을 에너지로 변환하는 복잡한 조립 라인이 가동됩니다. 이 기계 장치는 틸라코이드라고 불리는 얇고 기름진 막에 박혀 있는 거대한 단백질 구조들로 이루어져 있습니다. 이 구조들이 어떻게 작동하는지 이해하기 위해, 과학자들은 이들을 분해하지 않고 막에서 먼저 추출해내야 합니다. 이는 매우 섬세한 작업입니다. 일단 자유로워진 이 단백질 기계들은 물속에서도 안정적으로 유지되도록 계면활성제라는 비누 같은 물질의 보호 껍질에 싸이게 됩니다. 연구자들의 과제는 항상 이 서로 다른 기계들을 어떻게 서로 분류하느냐는 것이었습니다. 전통적으로 그들은 혼합물을 젤(gel)이라는 스펀지 같은 물질 속으로 강제로 통과시켜, 단백질의 크기에 따라 분리하는 방법을 사용해 왔습니다. 이 방법은 효과적이긴 하지만 결함이 있습니다. 젤은 시작 단계에서 서로 다른 모든 기계들을 좁은 공간에 밀집시키기 때문에, 종종 기계들이 끼이거나 섬세한 연결 구조를 잃어버리게 만듭니다.
연구팀은 이제 젤이나 스펀지 없이 완전히 액체 상태에서 이루어지는 새로운 단백질 분류 방식을 도입했습니다. 그들은 구간 구역 자유 흐름 전기영동(interval-zone free-flow electrophoresis)이라 불리는 기술을 사용했습니다. 넓고 얕은 강이 두 기슭 사이로 흐르는 모습을 상상해 보십시오. 연구진은 단백질 기계 혼합물을 이 강물 속으로 펌프질하여 넣습니다. 그런 다음 물 전체에 걸쳐 전기장을 가합니다. 모든 단백질 기계는 고유한 전기적 전하를 띠고 있기 때문에, 전기에 의해 하류를 따라 옆으로 밀려나게 됩니다. 전하가 더 큰 기계일수록 한쪽 측면을 향해 더 빠르게 이동하며, 전하가 적을수록 더 느리게 이동합니다. 흐르는 물을 일련의 작은 컵들에 모음으로써, 연구진은 오로지 전기적 전하만을 기준으로 단백질을 별개의 그룹으로 분리할 수 있습니다. 이 새로운 방식은 다른 분류가 일어나기 전, 전하를 기준으로 혼합물을 정리하는 첫 번째 단계 역할을 합니다.
연구진은 이 접근 방식을 흔한 애기장대 잎에서 추출한 단백질 복합체에 테스트했습니다. 그들은 먼저 디지토닌(digitonin)이라는 순한 비누를 사용하고, 그다음에는 더 강한 비누인 베타-도데실말토사이드(beta-dodecylmaltoside)를 사용하여 막의 서로 다른 부분들을 액체 속으로 끌어내는 일련의 추출 과정을 수행했습니다. 이 혼합물들을 액체 분류 시스템에 통과시켰을 때, 단백질들은 명확하고 뚜렷한 그룹으로 분리되었습니다. 연구진은 단백질의 전기적 전하가 이들을 구별하는 신뢰할 수 있는 방법임을 발견했습니다. 예를 들어, 광합성의 첫 번째 단계인 광계 II(Photosystem II)를 담당하는 기계들은 전기장의 양(+)의 방향을 향해 빠르게 이동했습니다. 반면, 두 번째 단계인 광계 I(Photosystem I)을 위한 기계들은 더 느리게 움직이며 음(-)의 방향 근처에 머물렀습니다. 또한 그들은 주요 기계에 부착되지 않고 자유롭게 떠다니는 빛 수확 안테나 그룹도 성공적으로 분리해 냈습니다.
이 작업의 핵심적인 부분은 단백질을 추출할 때 사용된 비누가 분류에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것이었습니다. 연구진은 용액 내의 비누 양이 단백질의 이동에 영향을 미친다는 것을 발견했습니다. 비누를 더 많이 첨가하면 단백질이 더 느리게 움직였는데, 이는 비누 분자들이 단백질 주위에 더 크고 무거운 껍질을 형성하여 전기적 전하를 희석시키기 때문입니다. 그들은 색이 있는 작은 염료가 비누 용액을 통해 이동하는 것을 관찰함으로써 이를 확인했는데, 비누 농도가 높아짐에 따라 염료의 이동 속도가 느려졌으며, 이는 비누 자체가 입자의 물리적 특성을 변화시킨다는 것을 증명했습니다. 이 발견은 깨끗한 분리를 위해서는 과학자들이 비누의 양을 정밀하게 조절해야 함을 의미합니다.
연구진이 새로운 액체 분류법을 전통적인 젤 방식과 비교했을 때, 두 접근 방식은 세상을 다르게 보고 있었습니다. 전통적인 젤은 단백질을 크기로 분류하는 반면, 새로운 액체 방식은 전하로 분류합니다. 이러한 차이는 강력한데, 왜냐하면 과학자들이 이전에는 숨겨져 있던 것들을 볼 수 있게 해주기 때문입니다. 기존의 젤 방식에서는 부분적으로 용해된 커다란 단백질 덩어리들이 종종 지저죽처럼 뭉쳐 보여 그 안에 무엇이 들어있는지 파악하기 어려웠습니다. 그러나 새로운 액체 방식에서는 이러한 덩어리들이 전하에 따라 서로 다른 컵으로 분류되었습니다. 연구진이 이 컵들의 내용물을 다시 젤로 통과시켰을 때, 그림은 훨씬 더 명확해졌습니다. 이전에 섞여 있었던 단백질들이 뚜렷한 그룹으로 구분되어 보였기 때문입니다.
또한 이 연구는 단백질 추출 순서가 중요하다는 것을 보여주었습니다. 연구진이 순한 비누를 먼저 사용했을 때는 ATP 합성효소(ATP synthase) 기계와 광계 I을 포함한 특정 단백질 세트를 추출했습니다. 그다음 남은 막에 더 강한 비누를 사용했을 때는 더 많은 광계 II 기계들을 추출했습니다. 액체 분류와 젤 분류를 결합함으로써, 그들은 각 추출 단계에 어떤 단백질이 존재하는지 정확히 지도화할 수 있었습니다. 그들은 일부 단백질 기계들이 막의 지방 성분인 지질(lipid)과 단단히 결합되어 있으며, 이 지질이 풍부한 버전들이 깨끗한 버전들과 다르게 움직인다는 것을 발견했습니다. 이는 단백질 주변의 환경, 즉 단백질에 붙어 있는 지질과 비누가 기계의 거동에 주요한 역할을 한다는 점을 시사합니다.
연구진은 이 액체 분류법이 복잡한 생물학적 기계를 연구하기 위한 우수한 첫 단계라고 결론지었습니다. 단백질이 과정 내내 액체 용액 상태로 유지되기 때문에, 젤을 통과하며 손상되거나 자연스러운 파트너를 잃어버릴 위험이 없습니다. 따라서 이 방식은 전자 현미경으로 단백질을 관찰하거나 다른 장비로 구조를 분석하는 등의 고급 기술을 위한 샘플을 준비하는 데 이상적입니다. 이 연구는 액체 상태에서 전기적 전하를 기준으로 단백질을 분리함으로써, 과학자들이 지구상의 생명을 움직이는 복잡한 기계 장치들을 훨씬 더 깨끗하고 정확하게 바라볼 수 있음을 입증했습니다.
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