Engineering of Giardia lamblia NADH Oxidase: A Single Point Mutation Yields an Efficient Dual-Specific Biocatalyst for Cofactor Regeneration

생명의 미세한 공장 안에서, 효소라고 불리는 아주 작은 분자들은 화학 반응을 일으키는 일꾼으로서 작용하며, 원료를 생명체가 생존하는 데 필요한 복잡한 물질로 변화시킵니다. 이러한 반응 중 상당수는 시작을 위해 코팩터(cofactor)라고 알려진 분자인 특정한 조력자를 필요로 합니다. 이 코팩터들을 효소가 작업을 수행하는 데 사용하는 충전 가능한 배터리라고 생각해보십시오. 생물학에서 가장 흔한 두 가지 배터리는 NADH와 NADPH입니다. 이들은 화학적으로 매우 유사하지만, 대부분의 효소는 까다로워서 한 종류의 배터리만 받아들이고 다른 종류는 거부합니다. 이러한 특이성은 과학자들이 의약품이나 기타 가치 있는 화학 물질을 제조하기 위해 효소를 사용하려고 할 때 마주하는 주요 장애물입니다. 만약 어떤 공장이 NADPH를 사용하는 공정을 가동해야 하는데, 사용 가능한 효소가 NADH하고만 작동한다면, 효소를 더 유연하게 만들 방법을 찾지 못하는 한 전체 시스템은 멈추게 됩니다.

멕시코시티의 국립 소아병리학 연구소(Instituto Nacional de Pediatría)의 연구진은 *기아르디아 람블리아(Giardia lamblia)*라는 미생물 기생충에서 추출한 특정 효소를 재설계함으로써 이 문제를 해결하는 데 중요한 진전을 이루었습니다. 물 형성 NADH 산화효소(water-forming NADH oxidase)로 알려진 이 효소는 가치 있는 것인데, 왜냐하면 사용된 배터리를 다시 충전된 상태로 재활용하면서 무해한 부산물로 오직 물만을 생성하기 때문입니다. 그러나 자연 상태의 이 효소는 NADH를 강력하게 선호하며 NADPH는 거의 무시합니다. 연구팀은 이 효소를 두 종류의 배터리를 모두 효율적으로 사용할 수 있는 다목적 촉매제로 만들어, 산업 화학 분야에서 다재다능한 도구로 만들기 위해 이 효소를 설계하는 데 착수했습니다. 컴퓨터 모델링과 정교한 구조 변화를 결집함으로써, 그들은 단 하나의 작은 변화만으로도 효소를 이중 목적의 촉매제로 변모시키기에 충분하다는 것을 발견했습니다.

연구진이 이 과업을 어떻게 달성했는지 이해하려면, 먼저 효소의 모양을 살펴보아야 합니다. 효소는 복잡한 3차원 구조로 접히는 단백질이며, 화학 반응이 일어나는 주머니(pocket)를 형성합니다. 이 주머니는 특정 배터리에 딱 맞도록 형성되어 있습니다. 자연 상태의 기아디아 효소에서 이 주머니는 NADPH 배터리에 들어있는 인산기(phosphate group)를 밀어내는 음전하 영역으로 둘러싸여 있어, 그것이 들어오는 것을 효과적으로 차단합니다. 연구진은 물리적인 결정 구조(crystal structure)가 없어 연구할 수 없었기에, 알파폴드(AlphaFold)라는 강력한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 효소의 매우 상세한 디지털 모델을 구축했습니다. 이 모델을 NADPH를 자연적으로 받아들이는 다른 유사한 효소들의 구조와 비교함으로써, 그들은 어떤 배터리를 효소가 받아들일지를 제어하는 것으로 보이는 특정 아미노산 루프(loop)를 식려냈습니다.

연구팀은 자연 상태의 효소가 위 세 지점에서 NADPH 친화적 버전들과 달랐던 점에 주목했습니다. 그들은 이 지점들의 화학적 성질을 바꾸면 NADPH를 차단하던 전기적 장벽을 제거할 수 있을 것이라고 가설을 세웠습니다. 이를 테스트하기 위해, 그들은 실험실에서 각 지점에 단 하나의 변화를 준 세 가지 서로 다른 버전의 효소를 만들었습니다. 그들은 박테리아 내에서 이 새로운 효소들을 배양하고 정제했으며, 변화가 단백질을 망가뜨리지 않았는지 확인하기 위해 구조를 점검했습니다. 결과는 효소의 전체적인 형태가 온전하게 유지되었음을 확인해주었으며, 이는 어떤 성능 변화가 구조의 붕괴가 아닌 특정 포켓의 변화로 인한 것임을 의미합니다.

연구진이 이 새로운 효소들이 얼마나 잘 작동하는지 테스트했을 때, 결과는 놀라웠습니다. 특정 아미노산을 다른 것으로 교체한 한 가지 변화는 효소의 선호도를 완전히 뒤집었습니다. 이 새로운 버전은 NADPH를 매우 좋아했지만 NADH를 사용하는 능력은 크게 상실했습니다. 또 다른 변화는 거의 아무런 영향도 미치지 못해, 효소를 원래처럼 까다롭게 남겨두었습니다. 그러나 세 번째 변화는 과학자들이 간절히 바랐던 정확한 결과를 만들어냈습니다. 단 하나의 음전하를 띤 아미노산을 중성인 것으로 교체함으로써, 그들은 NADPH를 차단하던 전기적 반발력을 제거했습니다. 이 단 한 번의 수정 덕분에 효소는 이전보다 훨씬 더 쉽게 NADPH를 붙잡을 수 있었고, 동시에 NADH 또한 거의 이전만큼 잘 유지할 수 있었습니다.

데이터에 따르면 이 새로운 이중 특이적 효소는 두 배터리 모두를 높은 효율로 처리할 수 있었습니다. 원래의 효소는 NADPH보다 NADH를 사용하는 능력이 13배 더 높았지만, 이 새로운 버전은 그 격차를 2 대 1 미만의 비율로 줄였습니다. 실질적인 관점에서, 이는 이제 이 효소가 두 종류의 배터리와 함께 작업하는 데 거의 똑같이 만족스러워한다는 것을 의미합니다. 연구진은 효소의 활성 부위(active site)의 전기적 표면을 매핑함으로써 이를 확인했는데, 포켓이 덜 음전하를 띠게 되었고 약간 더 커졌으며, 이는 NADPH 배터리를 위한 환영하는 공간을 만들었음을 보여주었습니다. 이 발견은 중요한데, 왜냐하면 이중 목적의 효소를 만들기 위한 이전의 시도들은 종종 여러 개의 복잡한 돌연변이를 요구했기 때문입니다. 여기서 단 하나의 표적화된 변화만으로도 새로운 능력을 끌어내는 데 충분했습니다.

이 연구는 과학자들이 안내할 물리적 결정 구조가 없더라도, 첨단 컴퓨터 모델을 사용하여 정밀한 단백질 설계를 예측하고 실행할 수 있음을 보여줍니다. 결과물인 이 효소는 산업 생명공학 분야에서 유망한 도구를 제공하며, 여기서 NADH 또는 NADPH를 모두 사용할 수 있는 능력은 제조 공정을 단순화하고 비용을 절감할 수 있습니다. 까다로운 효소를 유연한 효소로 바꿈으로써, 연구진은 더 적응력이 뛰어난 생물학적 도구를 만드는 청사진을 제공하였으며, 때로는 가장 작은 변화가 가장 다재다능한 결과를 낳을 수 있다는 것을 증명했습니다.