Structural basis of periplasmic bridge protein docking and nucleotide-dependent remodelling in lipopolysaccharide transport

기술 요약: 리포다당류 수송에서 Periplasmic Bridge 단백질 도킹 및 뉴클레오타이드 의존적 재구조화의 구조적 기초

문제 제기
그람 음성균의 외막은 내막으로부터 리포다당류(LPS)를 추출하여 주변세포질(periplasm)을 가로질러 외막으로 전달하는 리포다당류(LPS) 수송(Lpt) 기구에 의존한다. LptB2FGC라는 내막 ABC 수송체, LptA(Pseudomonas aeruginosa의 경우 LptH)라는 주변세포질 브릿지 단백질, 그리고 LptDE라는 외막 트랜스로콘(translocon)과 같은 개별 구성 요소들은 알려져 있으나, 수송체와 가용성 브릿지 사이의 결합을 조절하는 구조적 메커니즘은 아직 해결되지 않았다. 특히, 내막 수송체가 브릿지 구성 요소를 어떻게 모집하는지, 접합부(junction)가 ATPase 주기에 어떻게 반응하는지, 그리고 뉴클레오타이드 결합이 조립을 유도하는 것인지 아니면 이미 형성된 복합체를 단순히 재구조화하는 것인지가 불분명하다. 또한, thanatin과 같은 항균 펩타이드에 의해 이러한 인터페이스가 파괴되는 분자적 기초 역시 명확히 정의되지 않았다.

방법론
저자들은 네이티브 질량 분석법(native MS), 저온 전자 현미경(cryo-EM), 조건부 보충 분석(conditional complementation assays), 그리고 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 결합한 통합 구조 생물학적 접근 방식을 사용하였다.

• 시료 준비: P. aeruginosa LptH를 발현 및 정제하였으며, LptB2FGC는 지질 IVA를 생성하는 ClearColi 세포에서 발현시킨 후 탈지질화(delipidated)하였다. 이 복합체들은 지질 나노디스크(lipid nanodiscs)에 재구성되었다.
• 네이티브 MS: 용액 내 LptB2FGC-LptH 복합체의 화학 양론(stoichiometry)과 안정성을 평가하고, 항균 펩타이드인 thanatin에 의한 인터페이스의 순차적 파괴를 모니터링하는 데 사용되었다.
• Cryo-EM: LptB2FGC-LptH 복합체에 대해 뉴클레오타이드가 없는 상태(apo)와 AMP-PNP가 결합된 상태(nucleotide-engaged)의 두 가지 상태에 대해 단일 입자 분석을 수행하였다. 구조는 각각 3.24 Å 및 3.05 Å 해상도로 결정되었다.
• MD 시뮬레이션: 막 환경에서의 동적 거동, 인터페이스 안정성 및 배향 앙상블을 분석하기 위해 apo 및 ATP 결합 복합체에 대해 500 ns 시뮬레이션을 수행하였다.
• 기능 분석: 특정 잔기(residue)가 LptC-LptH 인터페이스에 미치는 기능적 중요성을 검증하기 위해 P. aeruginosa에서 조건부 보충 분석을 사용하였다.

주요 결과

1. 안정적인 복합체 형성: 네이티브 MS는 LPS 또는 뉴클레오타이드가 없는 상태에서도 LptH가 LptB2FGC와 안정적인 복합체를 형성함을 확인하였다. 수송체는 최대 두 분자의 LptH와 결합할 수 있으며, 단량체(monomeric) 형태가 복합체 내의 주요 종이다.
2. 접합부의 구조적 아키텍처: Cryo-EM 구조는 LptC의 C-말단 $\beta$-가닥과 LptH의 N-말단 $\beta$-가닥의 엣지 투 엣지(edge-to-edge) 쌍 형성을 통해 LptH가 LptC의 원위부(distal end)에 도킹됨을 보여준다. 이 $\beta$-가닥 증강(augmentation)은 $\beta$-젤리롤(jellyroll) 도메인을 연속적이고 고도로 뒤틀린 역평행 $\beta$-시트로 확장시켜, LPS가 수용성 주변세포질로부터 보호되도록 하는 소수성 홈(groove)을 형성한다.
3. 인터페이스 특이성: LptC-LptH 인터페이스는 조밀한 소수성 핵과 극성/전하 상호작용 네트워크에 의해 안정화된다. 개별 잔기들은 종간 서열 보존성이 낮지만, $\beta$-가닥의 구조적 상보성은 보존된다. 돌연변이 분석을 통해 이러한 특정 잔기들을 파괴하면 세포 생존력이 상실됨을 확인하였으며, 이는 해당 인터페이스의 기능적 필요성을 입증한다.
4. Thanatin에 의한 파괴 계층: 네이티브 MS와 MD 시뮬레이션은 항균 펩타이드인 thanatin이 정의된 순서에 따라 Lpt 조립체를 파괴함을 보여주었다. it은 더 높은 농도에서 더 광범위하고 안정적인 LptC-LptH 접합부를 파괴하기 전에, LptH-LptH 이량체 상호작용(표면적을 적게 숨김)을 우선적으로 표적하여 불안정하게 만든다.
5. 뉴클레오타이드 의존적 재구조화: 비가수분해성 ATP 유사체인 AMP-PNP를 결합하면, LptB 이량체가 닫히고 막 관통 공동(transmembrane cavity)이 붕괴된다. 결정적으로, 가용성 LptH 브릿지는 부착된 상태를 유지한다. 그러나 뉴클레오타이드 결합은 LptF-LptC 접합부에 집중된 구조적 변화를 유도하여, $\beta$-젤리롤 도와들의 분리를 일으키고 막 공동과의 연결을 좁힌다. 원위부 LptC-LptH 세그먼트는 조립된 상태를 유지하지만, MD 시뮬레이션 결과 약간 덜 조밀해지고 더 유연해짐을 보여준다.

의의 및 주장
본 논문은 P. aeruginosa의 수송체-브릿지 접합부의 원자 수준 아키텍처를 확립하여, LptH가 LptC에 어떻게 도킹되어 주변세포질 통로를 완성하는지 정의하였다. 저자들은 브릿지 조립이 LPS 로딩이나 뉴클레오타이드 결합과는 독립적으로 일어날 수 있는 선행 단계라고 주장한다.

핵심적인 발견은 뉴클레오타이드 결합이 브릿지 구성 요소의 모집이나 해리를 유발하는 것이 아니라, 이미 조립된 복합체를 재구조화한다는 것이다. 본 연구는 ATP 결가 결합이 내막 수송체의 폐쇄를 유도하고, 원위부 브릿지의 연속성(LptC-LptH)은 유지하면서 주변세포질 브릿지의 입구(LptF-LptC 접합부)를 선택적으로 재구조화하는 비대칭적 구조 반응을 밝혀냈다. 이는 Lpt 시스템이 뉴클레오타이드 구동 폐쇄가 브릿지를 끊지 않으면서도 주변세포질 통로로의 접근을 제어하는 체크포인트 역할을 하는 결합된 기계(coupled machine)로서 작동한다는 모델을 뒷받침한다.

마지막으로, 본 연구는 항균 펩타이드인 thanatin의 작용 기전을 규명하였으며, 이것이 수송체 근접 인터페이스에 비해 상대적으로 약한 LptH 자기 결합(self-association)을 이용한다는 것을 보여주었다. 이러한 발견은 LPS 수송의 협응된 역학에 대한 구조적 기초를 제공하며, Lpt 경로 내의 단백질-단백질 상호작용을 표적으로 하는 잠재적인 약리학적 전략에 대한 통찰을 제공한다.