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Autochthonous bioaugmentation with Pediococcus pentosaceus MZ-4 enhances indigoid production by accelerating indican biotransformation and remodeling the fermentation microbiome

본 연구는 *Pediococcus pentosaceus* MZ-4를 이용한 자생적 생물 증강이 β-글루코시다아제 활성을 통한 인디칸의 생물 전환을 가속화하고 발효 미생물 군집을 안정적인 유산균 중심의 공동체로 재편함으로써 인디고 내추럴리스(Indigo Naturalis) 생산을 유의미하게 향상시킨다는 것을 입증한다.

원저자: Xin Yang, Fangyu Xiang, Yun Duan, Qi Huang, Ming Yang, Xiangbo Yang, Hongya Yang, Li Han, Dingkun Zhang, Yanan He

게시일 2026-09-18

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CC BY 4.0

원저자: Xin Yang, Fangyu Xiang, Yun Duan, Qi Huang, Ming Yang, Xiangbo Yang, Hongya Yang, Li Han, Dingkun Zhang, Yanan He

원본 논문은 CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 라이선스로 제공됩니다. ⚕️ 이것은 동료 심사를 거치지 않은 프리프린트의 AI 생성 설명입니다. 의학적 조언이 아닙니다. 이 내용을 바탕으로 건강 관련 결정을 내리지 마세요. 전체 면책 조항 읽기

수 세기 동안 장인들은 데님에서 볼 수 있는 진한 청색 염료와 특정 혈액 질환 치료에 사용되는 의약 성분을 만들기 위해 조용하고 예측 불가능한 변화에 의존해 왔습니다. 이 과정은 인디고 식물의 잎을 물에 담가 발효를 시작하는 것으로부터 시작됩니다. 이 수중 환경에서 자연적으로 발생하는 미생물들이 잎 속에 숨겨진 무색의 화학 물질을 분해하여, 인디고라고 알려진 선명한 푸른 색소로 변화시킵니다. 이 방식은 수 세대 동안 아름다운 염료와 생명을 구하는 약품을 만들어 왔지만, 항상 도박과도 같았습니다. 이 과정은 느려서 완료하는 데 종종 며칠이 걸리기도 하며, 일을 수행하는 특정 미생물이 무엇인지 알 수 없고 통제되지 않기 때문에 결과가 매 배치마다 크게 달라집니다. 과학자들은 만약 그들이 이 화학적 변화를 일으키는 특정 박테리아를 식별하고 그들이 주도권을 잡도록 독려할 수 있다면, 이 과정을 더 빠르고, 더 신뢰할 수 있으며, 더 생산적으로 만들 수 있을 것이라고 오랫동안 의심해 왔습니다.

연구팀은 전통적인 발효 통 내부의 미시 세계를 면밀히 조사함으로써 이 퍼즐을 풀기 위해 나섰습니다. 그들은 먼저 침출액 샘ป์를 수집하고, 식물의 화학적 잠재력을 끌어낼 수 있는 효소를 생성하는 특정 박테리아를 찾기 시작했습니다. 수십 개의 서로 다른 균주를 분리한 끝에, 그들은 눈에 띄는 후보를 발견했습니다. 바로 '페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) MZ-4'라는 이름의 둥근 단세포 박테리아였습니다. 이 균주는 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase)라고 불리는 특정 도구, 즉 분자 가위와 같은 역할을 하는 효소를 높은 수준으로 생성한다는 점에서 특별했습니다. 이 효소의 역할은 인디칸(indican)이라는 전구체 화학 물질에서 당 분자를 잘라내어, 결국 푸른 색소가 되는 반응성 화합물을 방출하는 것입니다. 연구진은 이 균주를 테스트했고, 이 균주가 전통적인 공정의 온도와 산도 조건에서 효율적으로 작동한다는 것을 발견하여, 이 작업에 완벽하게 부합함을 확인했습니다.

이 박테리아가 정점에 도달할 수 있도록 하기 위해, 과학자들은 먼저 이 균주가 자라는 조건을 미세하게 조정했습니다. 그들은 온도, 물의 산도, 그리고 혼합물에 첨가되는 박테리아의 양을 조절하며, pH 6.0 정도의 약산성 환경과 섭씨 30도 근처의 온도가 이 균주가 가장 많은 효소를 생성하도록 한다는 것을 발견했습니다. 이러한 최적화된 조건 하에서, 박테리아는 표준 조건에서 생성할 때보다 훨씬 더 강력한 양의 필요한 효소를 생성했습니다. 이 강력한 균주가 준비되자, 연구팀은 주요 단계로 넘어갔습니다. 즉, 이 특정 박테리아를 전통적인 발효 통에 추가하는 것이 자연의 흐름에 맡기는 것과 비교하여 실제로 결과를 개선할 수 있는지 테스트하는 것이었습니다.

결과는 놀라웠습니다. 연구진이 페디오코쿠스 펜토사세우스 MZ-4 균주를 발효 탱크에 도입했을 때, 전체 과정이 현저히 빨라졌습니다. 여러 종류의 다양한 미생물에 의존하는 전통적인 방식은 투명한 액체가 짙은 청록색으로 변하는 데 보통 오랜 시간이 걸립니다. 하지만 새로운 균주를 접종한 탱크에서는 이 색상 변화가 약 12시간 더 빠르게 일어났습니다. 잎은 더 빨리 분해되었고, 화학적 변환은 더 긴박하게 일어났습니다. 과정이 끝날 무렵, 이 특정 균주로 처리된 탱크에는 전통적인 배치보다 인디고가 거의 47% 더 많이, 그리고 관련 있는 적자색 화합물인 인디루빈(indurubin)이 거의 58% 더 많이 포함되어 있었습니다. 이 두 화합물은 색상과 의학적 특성 모두를 위해 추구되는 귀중한 활성 성분입니다.

이 접근 방식의 성공은 새로운 균주가 통 안의 생명체 공동체 전체를 어떻게 재편했는지에 달려 있습니다. 전통적인 발효에서는 다양한 유형의 박테리아가 경쟁하며 혼란스럽고 예측 불가능한 환경을 초래합니다. 연구진이 페디오코쿠스 균주를 추가했을 때, 이 균주는 물을 더 산성으로 만들고 산소를 제거함으로써 환경을 빠르게 변화시키는 리더 역할을 했습니다. 이러한 변화는 덜 유익한 다른 박테리아들에게는 척박한 환경을 조성한 반면, 페디오코쿠스와 몇몇 관련 유익한 박테리아들이 장악할 수 있게 했습니다. 이러한 변화는 식물의 당을 효율적으로 분해하는 능력으로 알려진 유산균이 지배하는 안정적이고 조직적인 공동체를 형성했습니다. 연구진은 이 새로운 질서 정연한 공동체가 푸른색 및 붉은색 색소의 빠른 생산과 직접적으로 연결되어 있음을 확인했습니다.

이 박테리아가 어떻게 이러한 위업을 달성할 수 있었는지 이해하기 위해, 과학자들은 전체 유전 코드를 지도화했습니다. 그들은 이 균주의 DNA가 탄수화물을 분해하는 효소, 특히 글리코사이드 하이드롤라제(glycoside hydrolases)라고 알려진 거대한 도구 가족을 구축하기 위한 지시로 가득 차 있다는 것을 발견했습니다. 이들 중 베타-글루코시다아제 효소를 담당하는 유전자가 특히 풍부했습니다. 이러한 유전적 증거는 이 박테리아가 인디칸 분자에서 당을 잘라내어 색소 제조에 필요한 전구체를 방출할 수 있는 기계적 장치를 본래 갖추고 있음을 확인시켜 주었습니다. 이 연구는 단순히 더 빠른 염료 제조법을 찾은 것에 그치지 않고, 단 하나의 잘 선택된 미생물이 어떻게 복잡한 화학 과정을 안내할 수 있는지를 보여줌으로써 그 생물학적 메커니즘을 밝혀냈습니다.

이 작업은 고대의 관습을 현대화하기 위한 명확한 경로를 제시합니다. 특정 토착 박테리아를 식별하고 발효 과정에 추가함으로써, 생산자들은 자연 발생적 발효의 불확실성에서 벗어날 수 있습니다. 적절한 야생 미생물의 조합이 나타나기를 기다리는 대신, 반응을 가속화하고 원하는 제품의 수율을 보장하는 알려지고 신뢰할 수 있는 일꾼을 투입할 수 있습니다. 이 연구 결과는 "생물 증강(bioaugmentation)", 즉 도움이 되는 미생물로 시스템을 강화하는 방법이 천연 인디고와 그 의약 유도체의 생산을 더 효율적이고 일관되게 만들 수 있음을 시사하며, 이를 통해 전통적인 방식과 관련된 시간과 낭비를 줄이면서도 이러한 천연 자원의 가치를 보존할 수 있습니다.

기술 요약: 인디고이드 생산 향상을 위한 자생적 생물 증강 기술: Pediococcus pentosaceus MZ-4를 중심으로

문제 제식
만성 골수성 백혈병 치료의 핵심 성분인 청대(Indigo Naturalis)의 전통적인 생산 방식은 청대(Strobilanthes cusia) 잎의 자연 침지 발효에 의존한다. 이 공정은 긴 발효 주기, 통제 불가능한 미생물 천이, 심한 배치(batch) 간 편차, 그리고 활성 성분(인디고 및 인디루빈)의 낮은 수율이라는 특징을 갖는다. 이러한 비효로성은 주로 토착 미생물의 정의되지 않은 역할과 전구체인 인디칸(indican)의 제어되지 않은 효소적 전환에서 기인한다. 외생적 $\beta$ -글루코시다제( $\beta$ -glucosidase) 첨가가 시도되기도 했으나, 이는 높은 비용, 원료 추적성의 한계, 복잡한 개방형 발효 환경에 대한 낮은 적응성 등의 문제를 안고 있다. 따라서 미생물 천이를 유도하고 생체 전환 효율을 높이기 위해 토착 기능성 균주를 활용하는 지속 가능한 전략이 필요하다.

연구 방법론
본 연구는 격리, 특성 분석 및 기능성 토착 균주의 적용을 위해 다단계 접근 방식을 채택하였다:

균주 분리 및 스크리닝: 자연 발생적인 청대 발효 배지로부터 미생물을 분리하였다. 초기 스크리닝에서는 에스큘린-페릭 암모늄 시트레이트(aesculin-ferric ammonium citrate) 색도 검사를 사용하여 $\beta$ -글루코시다제 생성균을 식별하였다. 정량적 스크리닝에는 p-니트로페닐- $\beta$ -D-글루코피라노사이드(PNPG)법을 사용하여 5종의 고수율 균주를 선별하였다.
균주 특성 분석: 상위 5종의 균주에 대해 형태학적, 생화학적 및 분자적(16S rRNA/ITS 시퀀싱) 동정을 수행하였다. 인디칸 가수분해를 위한 최적 온도, pH, 열 안정성 및 운동학적 파라미터( $K_m$ , $V_{max}$ )를 평가하여 일반적인 발효 환경(통상 30°C, pH 5.5–7.5)에 가장 적합한 후보를 선정하였다.
기전 분석: 선정된 균주가 인디칸을 분해하고 인디고/인디루빈을 생성하는 능력을 테스트하였다. 대사체 프로파일링(HPLC-MS/MS)을 실시하여 분해 경로를 지도화하고 중간체를 식별하였다.
공정 최적화: 단일 인자 실험과 반응 표면 분석법(Box-Behnken 설계)을 사용하여 최대 $\beta$ -글루코시다제 생산을 위한 발효 조건(온도, 초기 pH, 접종량)을 최적화하였다.
생물 증강 및 비교 발효: 최적화된 균주를 자연 발효 시스템(MZ-4F 그룹)에 접종하고 자연 발효 대조군(NF 그룹)과 비교하였다. 물리화학적 변화(pH, 용존 산소, ORP), 미생물 군집 구조(16S rRNA amplicons sequencing), 대사체 축적량을 모니터링하였다.
유전체 분석: 전장 유전체 시퀀싱(Illumina 및 Oxford Nanopore)과 생물정보학적 주석 처리(COG, GO, KEGG, CAZy)를 수행하여 균주의 효소 능력에 대한 유전적 근거를 규명하였다.

주요 결과

균주 동정: 균주 MZ-4는 Pediococcus pentosaceus로 확인되었다. 이 균주는 그람 양성 구균 형태를 보였으며, 40°C 및 pH 6.0에서 최적의 활성을 나타내어 발효 과정에 매우 적합함을 입증하였다. 또한 발효 범위 내에서 높은 안정성을 보였다.
효소 운동학: MZ-4는 인디칸에 대해 높은 기질 친화도(높은 $K_m$ 값은 강한 결합력을 의미)를 나타냈다. 12시간 이내에 인디칸의 83.7% 이상을 분해하였으며, $\beta$ -글루코시다제에 의한 인독실(indoxyl) 가수분해 후 산화적 이량체화 및 고리화 과정을 거쳐 인디고와 인디루빈으로 전환하였다.
공정 최적화: 반응 표면 분석법을 통해 초기 pH 6.1, 온도 29.7°C, 접종량 5.4%의 최적 발효 조건을 도출하였다. 이를 통해 $\beta$ -글루코시다스 활성을 19.1 U/mL까지 증가시켰다.
발효 성능: MZ-4를 통한 생물 증강은 자연 발효 과정보다 약 12시간 빠르게 발효를 촉진하였다. 그 결과 인디고 수율은 47.46%, 인디루빈 수율은 58.19% 증가하였다.
미생물 군집 재편: 16S rRNA 시퀀싱 결과, MZ-4 접종은 초기 환경 선택을 강화하여 미생물 다양성을 빠르게 감소시켰다. 군집 구조는 변동성이 큰 다종 상태(자연 발효에서는 Proteobacteria와 Bacteroidetes가 우세)에서 안정적인 유산균 우점 상태(Pediococcus 및 Lactococcus)로 전환되었다. 이러한 변화는 pH, 용존 산소 및 산화-환원 전위(ORP)의 가속화된 감소와 상관관계를 보였다.
유전체 통찰: MZ-4의 전장 유전체 시퀀싱 결과, 44.75%의 GC 함량을 가진 3.13 Mb의 유전체를 확인하였다. 기능적 주석 처리 결과 406개의 탄수화물 활성 효소(CAZy)를 포함하여 121개의 글리코사이드 가수분해 효소(GH)를 식별하였다. 특히 GH1 패밀리 유전자가 두드러지게 나타났으며, 이는 관찰된 $\beta$ -글루코시다스 활성 및 인디칸 가수분해의 유전적 근거를 제공한다.

의의 및 주장
본 논문은 P. pentosaceus MZ-4를 이용한 자생적 생물 증강 전략이 전통적인 청대 생산의 비효율성을 해결할 수 있는 제어 가능하고 확장 가능한 솔루션을 제공한다고 주장한다. 특정 토착 기능성 균주를 도입함으로써 다음을 달 수 있음을 입증하였다:

전환 가속화: 발효 주기를 크게 단축하고 인디칸의 가수분해를 가속화한다.
수율 향상: 생체 활성 성분인 인디고와 인디루빈의 축적을 실질적으로 증가시킨다.
천이 유도: 미생물 군집을 무질서하고 변동성이 큰 공동체에서 유산균이 주도하는 안정적이고 기능적인 컨소시엄으로 재편한다.
기전적 근 근거 제공: 특정 유전적 특징(GH1 패밀리 유전자) 및 효소 활성을 제품 수율 및 공정 안정성 개선과 연결한다.

저자들은 이 접근 방식이 외생 효소나 화학적 첨가물에 의존하지 않고도 전통적 발효를 현대화할 수 있는 미생물 군집 유도 전략을 제공하며, 인디고 생성 식물 자원의 지속 가능한 바이오 프로세싱 및 가치 제고를 위한 경로를 제시한다고 결론지었다.

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