Spatial Mapping of Cytotoxic T Cell Exclusion Associated with Hypoxic PLAUR+ Macrophages in Triple-Negative Breast Cancer

기술 요약: 삼중음성 유방암에서 저산소증 PLAUR+ 대식세포와 연관된 세포독성 T 세포 배제의 공간적 매핑

문제 제기
삼축음성 유방암(TNBC)은 에스트로겐, 프로게스테론, HER2 수용체의 부재로 인해 표적 치료 옵션이 제한되어 상당한 치료적 과제를 안겨준다. 면역 관문 억제제(ICI)를 화학요법과 병용하는 것이 표준 치료법이 되었으나, 임상 반응은 여전히 이질적이며 많은 환자가 잔존 질환 및 재발을 경험한다. 이러한 이질성의 결정적인 요인은 세포독성 T 림프구(CTL)의 물리적 침투이다. CD8+ T 세포 침윤이 낮으면 예후가 좋지 않다는 것은 알려져 있으나, CTL의 접근을 막는 공간적 장벽을 형성하는 구체적인 미세환경 동인이 무엇인지는 아직 명확히 정의되지 않았다. 특히, 저산소증, 대식세포 재프로그래밍, 그리고 TNBC 종양 미세환경 내 CTL 배제 사이의 세포 및 분자적 메커니즘에 대한 추가적인 특성화가 필요하다.

방법론
본 연구는 전신 요법 전의 고유한 종양 미세환경(TME) 구조를 보존하기 위해, 치료를 받지 않은 초기 단계의 TNBC 환자를 대상으로 다중 모드 공간 전사체학 및 면역형광법을 적용하였다.

• 발견 코호트 (공간 전사체학): 저자들은 28명의 치료 전 환자(Stage I/II)로부터 얻은 76개의 종양 포함 코어에 대해 Xenium 5K 공간 전사체 플랫폼을 활용하였다. 품질 관리 후, 데이터셋은 약 499,000개의 세포로 구성되었다.
  • 분석 파이프라인: 세포는 계통 특이적 마커와 환자별 클러스터링을 사용하여 주요 계통 및 하위 클러스터로 주석을 달았다. 국소 세포 구성에 기반하여 Scimap 패키지를 통해 공간적 근접 영역(niche)을 식별하였다.
  • 층화: 종양 코어는 코호트 중앙값을 기준으로 "CTL-high"와 "CTL-low" 그룹으로 이분화되었다.
  • 컴퓨터 분석: Milo를 사용하여 차등 풍부도 테스트를 수행하였다. LIANA+를 사용하여 리간드-수용체 상호작용을 추론하였으며, Xenium 패널에 제한된 MSigDB Hallmark 유전자 세트를 사용하여 유전자 세트 점수(저산소증 및 TGF-β 신호 전달)를 계산하였다.
• 검증 코호트 (다중 면역형광법): 단백질 수준에서 발견된 내용을 검증하기 위해, 연구는 코호트를 134명의 치료 전 TN학 TNBC 환자(28명 중 27명 포함)로 확장하였다. CD8+ T 세포와 암 관련 섬유아세포(CAF)의 공간적 근접성을 평가하기 위해 다중 면역형광법(mIF)을 수행하였다. 이때 uPAR+(PLAUR+) 대식세포와의 관계를 측정하였으며, 핵 내 pSMAD2를 TGF-β 경로 활성화의 지표로 정량화하였다.

주요 기여 및 결과

1. 저산소성 대식세포 하위 집단(MC2)의 식별:
   본 연구는 LDHA, PLAUR 및 기타 당분해/저산소증 관련 유전자의 발현이 높은 독특한 대식세포 하위 집단인 **MC2(LDHA_PLAUR)**를 식별하였다. 이 집단은 CTL-low 종양에서 유의하게 농축되었으며, CTL 풍부도와 강한 음의 상관관계를 보였다. MC2 세포는 강력한 저산소증 시그니처를 나타냈으며, 종양 및 기질 니치 모두에서 발견되었다.

2. CTL 배제의 마커로서의 PLAUR:
   PLAUR(uPAR을 인코딩하는 유전자)는 CTL 침윤과 역상관 관계를 갖는 핵심 유전자로 확인되었다. PLAUR는 처음에 MC2에서 두드러졌으나, CTL-low 환경의 여러 대식세포 하위 집단에서 높은 발현이 관찰되었다. 공간 분석 결과, CTL은 PLAUR− 대식세포에 비해 PLAUR+ 대식세포의 즉각적인 근접 영역(반경 50 µm)에서 유의하게 적게 발견되었으며, 이는 PLAUR+ 대식세포가 면역 억제 니치의 중심임을 시사한다.

3. 섬유아세포와 대식세포 간의 PLAU–PLAUR 신호 전달 축:
   근접성 농축 분석을 통해 PLAUR+ 대식세포가 특정 암 관련 섬유아세포(CAF) 하위 집단, 특히 **FB0(MMP11_COL11A1)**와 우선적으로 공존함을 입증하였다.

   • 리간드-수용체 상호작용: 섬유아세포(특히 FB0)는 높은 수준의 리간드 PLAU(uPA)를 발현하는 반면, 대식세포(특히 MC2)는 수용체 PLAUR를 발현하였다.
   • 신호 전달 강도: PLAU(FB0)–PLAUR(MC2) 축의 리간드-수용체 상호작용 점수는 CTL-high 코어에 비해 CTL-low 코어에서 유의하게 높았다.

4. TGF-β 경로 활성화와의 결합:
   본 연구는 이러한 공간적 상호작용과 TGF-β 신호 전달 사이의 연결 고리를 확립하였다.

   • PLAUR+ 대식세포와 공존하는 섬유아세포가 풍부한 니치는 저산소증 및 TGF-β 신호 전달 점수 모두에서 높은 수치를 보였다.
   • 대식세포의 PLAUR 발현은 인접한 기질 세포의 TGF-β 신호 전달 점수와 양의 상관관계를 보였다.
   • 단백질 검증: mIF 분석 결과, uPAR+ 대식세포 주변의 CAF는 uPAR− 대식세포 주변의 CAF보다 유의하게 높은 핵 내 pSMAD2(활성 TGF-β 신호 전달)를 나타냈다. 동시에, uPAR+ 대식세포 주변에서는 CD8+ T 세포 밀도가 감소하였다.

5. 임상적 상관관계:
   CAF 인접, CD8 결핍 uPAR+ 대식세포(하위 그룹 C2)의 부담이 높은 환자들은 더 큰 종양 크기, 높은 T 카테고리, 그리고 유의하게 높은 혈관 림프 침윤 빈도를 포함한 더 공격적인 특징을 보였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석 결과, 이 하위 그룹은 더 짧은 전체 생존율을 보이는 것으로 나타났으나, 혈관 림프 침윤을 보정했을 때 그 연관성이 약화되었다. 이는 이 면역 배제 니치와 침습 가능성 사이의 잠재적인 기계적 연결을 시사한다. 또한, 독립적인 데이터셋에서 신생 보조 화학요법 후 병리학적 완전 관해를 달성한 환자들에 비해 잔존 질환이 있는 환자에서 골수성 PLAUR 발현이 더 높았다.

의의
본 논문은 저산소성 TNBC 미세환경 내에서 대식세포-섬유아세포 상호작용을 세포독성 T 세포 배제로 연결하는 특정 "uPAR–TGF-β 축"을 정의한다고 주장한다. PLAUR+ 대식세포를 이러한 배제의 핵심 동인으로 식별함으로써, 본 연구는 왜 CTL이 특정 TNBC 영역에 침투하지 못하는지에 대한 공간적으로 해상된 메커니즘을 제공한다. 이러한 결과는 면역 배제 표현형이 균일한 종양 전체의 특성이 아니라, 저산소증 대식세포와 활성화된 섬유아세포에 의해 국소적으로 조직화된 과정임을 시사한다. 이 공간적 특성화는 섬유화 장벽이나 TGF-β 신호 전달을 차단하는 약제와 결합하여 uPAR 관련 TME를 표적으로 하는 치료 전략의 잠재적 근거를 제시한다. 연구는 잠재적인 TGF-β 활성화를 유도하는 PLAU-PLAUR 상호작용의 기능적 검증 부족과 표적화된 Xenium 프로브 세트의 제약 등 한계점도 겸허히 언급하였다.