TileBac - an annotated ultralow-dose cryo-EM montage of bacterial membranes and flagella

박테리아의 세계를 이해하기 위해 과학자들은 종종 세포의 아주 미세한 가장자리를 들여다봐야 합니다. 박테리아는 병원에서 지속적인 오염을 일으키거나 산업용 파이프를 막을 수 있는 아주 작은 단세포 생물입니다. 그중 많은 종류, 예를 들어 그람 음성균은 내막과 외막이라는 두 개의 보호층으로 둘러싸여 있습니다. 이 층들 사이에는 박테리아가 스트레스를 받거나 항생제와 싸울 때 모양이 변할 수 있는 얇은 공간이 존재합니다. 이러한 섬세한 구조를 명확하게 보기 위해 연구자들은 저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy)이라는 기술을 사용합니다. 이 방법은 박테리아를 얇은 얼음 층 안에 급속 냉동하여, 형태를 왜곡하는 데 흔히 쓰이는 무거운 화학 염색 없이도 거의 자연스러운 상태 그대로 보존하여 촬영할 수 있게 해줍니다. 하지만 여기에는 함정이 있습니다. 이 냉동 샘플들은 매우 취약합니다. 사진을 찍는 데 사용되는 전자빔이 너무 강하면 샘플을 태워버려 과학자들이 보고자 하는 바로 그 세부 사항들을 파괴합니다. 반대로 빔이 너무 약하면 이미지가 너무 거칠어져서, 박테리아가 헤엄치는 데 도움을 주는 채찍 같은 꼬리인 편모나 얇은 막을 식별하기 어렵습니다.

이 섬세한 균형 잡기는 오랫동안 과학자들이 박테리아 집단에 대해 배울 수 있는 양을 제한해 왔습니다. 그들은 넓은 영역을 빠르게 낮은 선량으로 찍어 세부 사항을 거의 보지 못하거나, 아주 작은 지점을 높은 선량으로 찍어 뛰어난 세부 사항을 얻는 대신 더 큰 그림을 놓치는 것 중 하나를 선택해야 했습니다. 오크리지 국립연구소(Oak Ridge National Laboratory)의 연구진이 만든 TileBac라는 새로운 데이터셋은 이러한 트레이드오프를 깨뜨리는 방법을 제시합니다. 연구팀은 팝러 나무 뿌리 주변 토양에 서식하는 특정 박테리아인 Pantoea sp. YR343로부터 방대한 이미지 라이브러리를 수집했습니다. 그들은 냉동된 박테리아의 광시야 파노라마를 촬영한 다음, 이를 관리하기 쉬운 작은 조각들로 나누는 방식을 사용했습니다. 결정적으로, 그들은 모든 조각에 대해 수작업으로 주석을 달아 내막과 외막, 그리고 편모의 정밀한 윤곽을 그렸습니다. 이는 컴퓨터가 아주 거친 저선량 이미지에서도 이러한 희미한 구조를 찾아내는 법을 배울 수 있도록 하는 훈련장이 됩니다.

연구진은 컴퓨터에 서로 다른 것을 가르치도록 설계된 두 가지 별도의 데이터 세트를 만드는 방식으로 이 과제에 접근했습니다. 첫 번째 세트는 박테리아의 외피(envelopes)에 초점을 맞춥니다. 그들은 평방 옹스트롬당 단 4개의 전자만을 사용하는 극도로 낮은 방사선량의 광시야 이미지를 촬영했습니다. 이 수준에서 이미지는 매우 노이즈가 심하며, 막은 사람의 눈으로는 거의 보이지 않습니다. 이를 파악하기 위해 팀은 수천 개의 이미지 타일에 내막과 외막을 따라 다각형을 직접 그렸습니다. 그런 다음 이 손으로 그린 지도를 사용하여 다섯 가지 유형의 컴퓨터 비전 모델을 학습시켰습니다. 목표는 신호가 믿기지 않을 정도로 약할 때도 기계가 두 개의 막 층을 구별할 수 있는지 확인하는 것이었습니다. 결과는 일부 모델은 어려움을 겪었지만, 단순한 선이 아닌 채워진 영역을 찾는 데 특화된 모델들은 성공적으로 막을 식별할 수 있음을 보여주었습니다. 이는 적절한 훈련 데이터가 있다면 컴퓨터가 우리 눈에 거의 보이지 않는 구조를 볼 수 있다는 것을 증명합니다.

두 번째 데이터 세트는 박테리아의 움직임과 부착 문제를 다룹니다. 박테리아는 헤엄치기 위해 길고 가는 편모를 사용하며, 이 구조는 이들이 표면에 달라붙는 방식에 있어 매우 중요합니다. 연구진은 편모가 있는 박테리아의 이미지를 평방 옹스트로당 40개의 전자를 사용하는 약간 더 높은 선량으로 수집했는데, 이는 여전히 저선량으로 간주되지만 훨씬 더 명확한 세부 사항을 제공합니다. 또한 그들은 동일한 시야를 영화처럼 기록하여 각 이미지당 40개의 개별 프레임을 포착했습니다. 이는 연구자가 원하는 어떤 선량 수준에서도 이미지를 재구성할 수 있게 해주는 강력한 기능입니다. 연구자는 가장 낮은 선량에서 박테리아가 어떻게 보이는지 보기 위해 단 하나의 프레임만 합칠 수도 있고, 40개 프레임을 모두 합쳐 가장 선명한 버전을 볼 수도 있습니다. 이 모든 과정에서 동일한 박테리아를 동일한 위치에 유지함으로써, 연구진은 이미지 품질이 매우 흐릿한 상태에서 매우 선명한 상태로 변함에 따라 컴퓨터 모델이 얼마나 잘 작동하는지 확인할 수 있는 완벽한 테스트 베드를 만들었습니다.

이 데이터셋을 진정으로 독특하게 만드는 것은 주석(annotations)의 세밀함입니다. 이전 연구들에서는 과학자들이 단순히 박테리아가 있는 위치만을 표시했을 수 있습니다. 그러나 여기에서 연구진은 내막과 외막을 각각 별개의 개체로서 구체적인 모양으로 그렸습니다. 그들은 내막과 외막이 상당 부분 겹치는 영역을 둘러싸고 있으며, 내측 영역이 외측 영역 안에 깔끔하게 들어가 있다는 것을 발견했습니다. 이러한 수준의 정밀함은 공개 데이터베이스에서 보기 드문 것입니다. 연구팀은 또한 서로 다른 컴퓨터 모델들이 세상을 보는 방식이 다르다는 것을 발견했습니다. YOLO 시스템을 기반으로 하는 모델과 같은 일부 모델은 외막을 마치 와이어 프레임처럼 매우 가는 선으로 그리는 법을 배웠습니다. 반면 U-Net이나 SAM과 같은 다른 모델들은 막 내부의 전체 영역을 채우는 법을 배웠습니다. 두 접근 방식 모두 유효하지만, 성공을 측정하는 방식은 다릅니다. 만약 모델이 차지하는 면적만을 본다면, 얇은 선 모델들은 실패한 것처럼 보일 것입니다. 하지만 그 선이 실제 가장자리와 얼마나 가까운지를 측정한다면, 동일한 모델들이 매우 우수하게 수행했다는 것을 알 수 있습니다. 이 차이는 향후 연구에 매우 중요한데, 이는 과학자들이 경계의 모양을 알고 싶은지 아니면 면적의 크기를 알고 싶은지에 따라 적절한 도구를 선택해야 함을 알려주기 때문입니다.

또한 이 데이터 세트는 대규모 이미징에서 흔히 발생하는 스티칭(stitching) 문제를 다룹니다. 과학자들이 넓은 영역의 파노라마를 찍을 때, 여러 개의 작은 이미지를 결합해야 합니다. 만약 컴퓨터가 이들을 완벽하게 정렬하지 못하면, 이미지 사이의 이음매가 박테리아를 가로질러 지나가면서 박테리아가 끊어지거나 왜곡된 것처럼 보이게 만들 수 있습니다. TileBac 데이터 세트에는 원래의 광시야 파노라마와 작은 타일들이 모두 포함되어 있어, 연구자들이 소프트웨어가 세포의 온전함을 잃지 않고 이미지를 얼마나 잘 이어 붙이는지 테스트할 수 있게 해줍니다. 연구진은 이 데이터 세트에 겹치는 세포가 없다는 것을 발견했는데, 이는 컴퓨터가 개별 박테리아를 분리하는 법을 테스트하기에는 완벽하지만, 박테리아가 서로 빽빽하게 모여 있는 경우를 처리하는 법을 테스트하는 데는 사용할 수 없음을 의미합니다. 데이터의 한계에 대한 이러한 정직한 고지는 데이터 자체만큼이나 중요하며, 이는 다른 과학자들이 잘못된 결론을 내리는 것을 방지합니다.

이 모든 데이터를 학습된 컴퓨터 모델 및 분석에 사용된 코드와 함께 공개함으로써, 오크리지 팀은 이 분야의 새로운 표준을 제시했습니다. 그들은 매우 낮은 선량으로 인해 이전에는 유용하게 쓰이기 어렵다고 여겨졌던 넓은 영역의 박테리아 샘플을 수집하는 것이 가능하다는 것을 보여주었습니다. 또한 세심한 수작업 주석을 통해 컴퓨터가 이러한 희미한 구조를 찾아낼 수 있음을 입증했습니다. 그리고 연구자들이 나노 규모에서 생명체를 관찰하는 능력이 이미지 품질에 따라 어떻게 변하는지 연구할 수 있는 유연한 도구를 제공했습니다. 이 작업이 박테리아 이미징의 모든 문제를 해결하는 것은 아니지만, 차세대 도구들을 위한 필수적인 기초를 제공합니다. 이는 과학자들이 운 좋게 얻은 몇 개의 고품질 이미지를 보는 단계에서 벗어나, 통계적 확신을 가지고 박테리아 전체 집단을 분석할 수 있게 함으로써, 이 작은 생명체들이 환경 및 접촉하는 물질과 어떻게 상호작용하는지에 대한 더 깊은 이해로 가는 문을 열어줍니다.