Bacteria getting wired: The porin-cytochrome complex Om(abc)B kickstarts extracellular electron transfer and nanowire formation

기술 요약: 박테리아의 배선 연결: 포린-사이토크롬 복합체 Om(abc)B가 세포 외 전자 전달 및 나노와이어 형성을 촉발하다

문제 제기
세포 외 전자 전달(EET)은 무산소 환경에서 미생물 호흡에 있어 핵심적인 과정이며, 생물지구화학적 순환을 주도하고 바이오 에너지 및 생물 정화 분야의 응용을 가능하게 한다. 수십 년간의 연구에도 불구하고, 높은 중복성으로 인해 Geobacter sulfurreducens가 사용하는 구체적인 경로와 구성 요소는 여전히 불분명하다. 기존 모델은 포린-사이토크롬 복합체(PCC), 특히 Om(abc)B 복합체가 표면에 전시된 고분자 사이토크롬 "나노와이어"(OmcS)로 전자를 전달하여 불용성 Fe(III) 산화물로 장거리 EET를 촉진한다고 가정한다. 그러나 PCC와 나노와이어 사이의 기계적 관계, 그리고 OmcB가 EET를 개시하는 데 있어 갖는 구체적인 역할은 여전히 해결되지 않은 과제로 남아 있었다. 더욱이, OmcB에 대한 이전의 구조 및 기능 연구는 단백질의 형태와 산화환원 특성을 변화시켰을 수 있는 가혹한 정제법으로 인해 제한적이었다.

연구 방법
저자들은 유전학, 생화학, 생물물리학 및 계산 생물학을 결합한 다학제적 접근 방식을 채택하였다:

• 유전적 분석: 야생형(WT) 및 다양한 돌연변이체( $\Delta$om(abc)B, $\Delta$omcS, 그리고 OmcS의 급격한 생산을 위해 설계된 $\Delta$oscG:pOscG 균주 포함)의 성장 역학을 Fe(III) 산화물 및 Fe(III) 시트르산 매질에서 모니터링하였다. 나노와이어의 사전 형성 영향을 평가하기 위해 접종 단계(지수 성장기 vs. 정지기)를 다양화하였다.
• 단백질 정제: 고순도의 천연 Om(abc)B를 얻기 위해, 저자들은 외부 숙주(예: E. coli)를 피하고 G. sulfurreducens에서 Strep(II)-태그 복합체를 발현시킨 후 Strep-친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. OmcB와 Om(ab)B 하위 복합체의 결합을 확인하기 위해 천연 지질 나노디스크를 활용하였다.
• 생물물리학적 특성 규명: 정제된 단백질들을 UV-Vis 분광법, 2차 구조 및 엑시톤 결합(excitonic coupling)을 위한 원편광 이색성(CD), 그리고 헤임(heme)의 전자 상태를 특징짓기 위한 5 K에서의 전자 상자성 공명(EPR)으로 분석하였다. OmcB와 Om(ab)B의 중간 산화환원 전위($E_m$)를 결정하기 위해 분광 전기 화학법을 사용하였다.
• 역학 분석: 정제된 OmcB와 OmcS 나노와이어의 Fe(III) 환원 속도를 측정하여 전자 전달 속도 상수를 계산하였다.
• 상호작작용 연구: 크기 배제 크로마토그래피와 면역 금 표지법을 통해 OmcB와 OmcS 사이의 단백질-단백질 상호작용을 테스트하였다. 물리적 상호작용을 예측하기 위해 Evcouplings를 이용한 공진화 분석을 수행하였다.
• 계통 발생학: NCBI 데이터베이스와 PSI-BLAST를 사용하여 다양한 박테리아 문(phyla)에서 Om(abc)B 오페론과 OmcS 생합성 클러스터의 분포를 매핑하였다.

주요 결과

1. 독립적인 EET 경로: 유전적 연구 결과, OmcB와 OmcS 나노와이어는 순차적인 폭포(cascade) 구조가 아니라 독립적이고 평행한 경로로 기능한다는 것이 밝혀졌다. $\Delta$om(abc)B 돌연변이는 Fe(III) 산화물에서 유의미한 성장 지연을 보였으나, 결국 회복되어 WT와 유사한 OmcS 나노와이어를 생성했다. 반대로, (정지기 접종 또는 과발현 설계를 통해) OmcS 나노와이어가 미리 로딩된 세포들은 OmcB가 완전히 없는 상태에서도 Fe(III) 산화물에서 빠르게 성장했다.
2. 전사 후 조절: OmcS 나노와이어의 존재는 omcB 전사 수준은 변하지 않았음에도 불구하고 OmcB 단백질 생산의 완전한 차단을 유도한다. 이는 나노와이어 합성이 PCC 생산에 대한 음성 조절자로 작용하는 전사 후 조절 메커니즘이 존재함을 나타낸다.
3. 구조 및 전자적 특성: 정제된 Om(abc)B 복합체는 강한 엑시톤 결합을 가진 저스핀 c-type 헤임을 나타냈으며, 높은 열 안정성($T_m \approx 63^\circ$C)을 보였다. 분광 전기 화학을 통해 결정된 OmcB와 Om(ab)B의 중간 산화환원 전위는 각각 -167 mV 및 -182 mV (vs. SHE)였다. 이러한 값들과 AlphaFold3로 예측된 헤임 배열은 진화적으로 최적화되고 간소화된 전자 전달 경로를 시사한다.
4. 역학적 효율성: OmcB는 OmcS 나노와이어보다 단백질 분자당 Fe(III) 산화물을 환원하는 효율이 약 5배 더 높았다. 그러나 나노와이어는 OmcB가 도달할 수 없는 1 $\mu$m 이상의 거리에 있는 전자 수용체에 접근하는 데 필수적이다.
5. 물리적 상호작용의 부재: 생화학적 분석과 공진화 분석은 OmcB가 OmcS로 전자를 직접 전달한다는 기존의 가설과 달리, 두 단백질 사이의 안정적인 물리적 결합 증거를 찾지 못했다.
6. 계통 발생적 분포: Om(abc)B 오페론은 다양한 미생물 문에 널리 분포되어 있으며, 종종 OmcS 생합성 유전자와 공존한다. 이는 이 이중 경로 전략이 보존된 진화적 적응임을 시사한다.

의의 및 주장
본 논문은 Om(abc)B 복합체가 세포 외 호흡의 "스타터(kickstarter)" 역할을 한다는 것을 입증함으로써 G. sulfurreducens의 EET 메커니즘에 대한 이해를 재정의한다고 주장한다. 저자들은 세포가 표면에 결합된 전자 수용체를 환원하여 OmcS 나노와이어 합성에 필요한 에너지를 생성하기 위해 효율적이고 비용이 적게 드는 OmcB 경로를 사용하는 "디옥식(diauxic) 유사" 대사 전략을 제안한다. 일단 나노와이어가 형성되면, 이는 세포 복제에 필요한 방대한 양의 Fe(III)에 접근할 수 있도록 하며, 이때 단백질 자원 배분을 최적화하기 위해 OmcB 생산이 억제된다.

이 연구는 OmcB가 단순히 나노와이어로 향하는 통로가 아니라, 세포 내 대사에서 세포 외 대사로의 전환에 필수적인 독자적이고 매우 효율적인 환원효소임을 강조한다. 이러한 발견은 왜 OmcB가 성장 개시에는 결정적이지만, 나노와이어가 형성된 세포의 장기적 성장에는 필수적이지 않은지에 대한 역설을 해결한다. 저자들은 PCC와 나노와이어 사이의 이러한 전환 메커니즘이 다양한 미생물 종에서 보편적인 특징일 수 있다고 제안하며, 이는 바이오 에너지 및 생물 정화 응용 분야에서 EET를 설계하기 위한 새로운 길을 제시한다.