Development of an Edible Vaccine Using Conserved PspA Epitopes Against Pneumococcal Infection in a Murine Model

기술 요약: 마우스 모델을 이용한 폐렴구균 감염에 대한 보존된 PspA 에피토프 기반 식용 백신 개발

문제 제기
Streptococcus pneumoniae(폐렴구균)는 특히 방글라데시와 같은 개발도상국에서 호흡기 감염, 수막염 및 패혈증의 주요 원인으로 남아 있다. 항생제와 기존 백신이 존재하지만, 약제 내성 균주의 증가와 기존 백신의 콜드체인 의존적 물류 문제를 해결하기 위해 혁신적인 대안이 필요하다. 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA)는 매우 흔하게 발견되는 표면 분자이자 핵심 독성 인자로, 모든 S. pneumoniae 분리주에 존재하여 광범류 백신 타겟으로서 유망하다. 그러나 PspA는 높은 유전적 가변성을 보인다. 본 연구는 식물 기반 발현 시스템을 활용하여 생산 및 유통 장벽을 극복하고, 보존된 B세포 에피토프를 타겟팅함으로써 비용 효율적이고 경구 투여가 가능한 백신을 개발하고자 한다.

연구 방법론
본 연구는 "역 백신학(reverse vaccinology)" 접근법과 Agrobacterium 매개 식물 형질전환 및 마우스 챌린지 모델을 결 함께 사용하였다.

1. 에피토프 식별 및 설계:

   • Kolaskar-Tongaonkar 항원성 분석법과 Emini 표면 접근성 예측을 이용한 계산 분석을 통해 PspA 단백질로부터 네 가지의 보존된 선형 B세ล์ 에피토프를 식별하였다: (i) ILTSLASVAILGAGFVASQPTVVRAEESPVASQ, (ii) AQKKYEDDQKKTEE, (iii) SESEDYA, (iv) SKAEKDYDAA.
   • 다중 서열 정렬(MSA) 결과, 이 에피토프 서열들은 분석된 PspA 서열 전반에 걸쳐 완벽하게 보존되어 있음을 확인하였다.
   • 에피토프 서열은 식물에서의 이종 발현을 위해 코돈 최적화를 거친 후 저장 단백질과 융합되었다. 에피토프 1은 **알파 제인(alpha zein)**에 융합되었고(Construct Alpha), 에피토프 2, 3, 4는 **감마 제인(gamma zein)**의 N-말단 90개 아미노산에 융합되었다(Construct Gamma).
   • 컨스트럭트에는 검출 태그(Alpha의 경우 FLAG 및 His; Gamma의 경우 His만 포함)가 포함되었으며, nptII 카나마이신 저항성 유전자와 Agrobacterium 복제 기원을 포함하는 바이너리 벡터에 클로닝되었다.

2. 식물 형질전환:

   • 컨스트럭트들을 Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404로 전달하였다.
   • Lycopersicon esculentum(토마토) 잎 디스크 및 기타 외편(explant)을 해당 박테리아와 공동 배양하였다.
   • 단계적으로 증가하는 카나마이신 농도(최대 300 mg/l)를 사용하여 형질전환된 슈트를 선별하였으며, 100 mg/l가 최적의 선택 압력으로 확인되었다.
   • 재생된 슈트는 컨스트럭트 특이적 프라이머를 이용한 PCR 및 anti-His-tag 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 통해 확인되었다.

3. 면역화 및 챌린지:

   • 총 72마리의 Swiss Albino 마우스를 사용하여 두 차례의 독립적인 시험을 수행하였다.
   • 마우스들에게 형질전환 토마토 잎 조직(그룹 1 및 2) 또는 비형질전환 조직(대조군 그룹 3)을 6주 동안 경구 면역화하였다.
   • 면역화 후, 치사량 10배(10x LD50)의 병원성 S. pneumoniae 혈청형 7F를 복강 내로 챌린지하였다.
   • 생존율은 30일 동안 모니터링되었다. 통계 분석은 SPSS(t-test, One-way ANOVA, Duncan Multiple Ranked Test)를 사용하여 수행되었다.

주요 결과

• 분자적 확인: PCR 분석을 통해 알파 및 감마 제인 유전자가 토마토 게놈에 통합되었음을 확인하였다. 웨스턴 블로팅을 통해 융합 단백질의 발현을 검출하였으나, 감마 융합 단백질은 이량체화(dimerization) 가능성으로 인해 예상보다 더 크게 나타났다.
• 생존율:
  • 대조군: 두 시험 모두에서 50% 생존율(6/12 마리)을 보였다.
  • 알파 제인 그룹: 시험 1에서 83.3% 생존(10/12 마리); 시험 2에서도 일관되게 높은 생존율을 보였다.
  • 감마 제인 그룹: 시험 1에서 75% 생존(9/12 마리); 시험 2에서는 50% 생존(변동 사항이 관찰되었으나 전체적인 경향은 보호 효과를 보임).
• 통계적 유의성:
  • T-test 결과, 면역화된 그룹 간의 생존율 차이는 유의미하지 않았으며(p > 0.05), 이는 재현성을 확인해 준다.
  • One-way ANOVA 및 사후 검정 결과, 형질전환 식물(Alpha 및 Gamma)을 섭취한 마우스의 생존율이 대조군보다 유의하게 높았다(p < 0.05).
  • Duncan Multiple Ranked Test에서 면역화된 그룹은 대조군과 구별되는 뚜렷한 동질적 하위 집단을 형성하였다.

의의 및 주장
본 논문은 PspA의 보존된 에피토프를 제인 단백질에 융합하여 토마토 식물에서 폐렴구균 감염에 대한 식용 백신 개발이 가능하다는 것을 성공적으로 입증했다고 주장한다. 본 연구의 주요 의의는 마우스 모델에서 유의미한 보호 효능을 입증했다는 점에 있으며, 여기서 형질전환 식물 조직의 경구 섭취가 치명적인 S. pneumoniae 혈청형 7F 챌린지에 대해 보호 효과를 부여하였다.

저자들은 PspA 내에서 식별된 면역원성 핫스팟이 새로운 경구용 폐렴구균 백신의 유망한 후보임을 강조한다. 저자들은 본 연구가 형질전환 식물 생산과 생존 이점을 성공적으로 확립했으나, 상세한 면역학적 특성 규명(항체 역가, ELISA, 점막 IgA, 사이토카인 프로파일링 등)은 포함되지 않았으며 향후 단계에서 계획되어 있다고 언급하였다. 이 연구는 자원이 제한된 지역을 위한 저렴하고 확장 가능하며 바늘이 필요 없는 백신 전달 시스템을 향한 중요한 단계로 제시된다.