Integrative genomic and transcriptomic analyses identify functionally relevant causal genes for exercise in a large animal model

기술 요약: 서러브레드 말의 운동에 대한 통합적 유전체 및 전사체 분석

문제 제기
서러브레드 말은 경주를 위한 독특한 해부학적 및 대사적 적응을 보유하고 있어, 운동 유전체학 연구를 위한 매우 특화되고 선택된 동물 모델을 대표한다. 기존 연구들은 경주 성능과 관련된 유전적 변이(특히 MSTN 유전자좌)를 식별하기 위해 전장 유전체 연관 분석(GWAS)을 활용하였고, 운동에 대한 전사적 반응을 매핑하기 위해 발현 양적 형질 유전자좌(eQTL) 분석을 사용해 왔으나, 인과적 메커니즘에 대한 포괄적인 이해는 여전히 불완전하다. 구체적으로, 전사체 연관 분석(TWAS), 공국소화(colocalisation) 분석, 그리고 요약 통계 기반 멘델 무작위 배정(SMR)을 동시에 활용하여 유전된 유전적 메커니즘과 운동 및 훈련에 의한 획득된 분자적 반응을 구분한 선행 연구는 없다. 또한, 다양한 생리적 상태(비훈련 휴식, 급성 운동, 훈련된 휴식)에 따른 eQTL 효과 크기의 변이가 어떤 포유류 종에서도 체계적으로 규명된 바 없다.

연구 방법론
본 연구는 세 가지 서로 다른 운동/훈련 상태에서 샘플링된 141마리의 서러브레드 말로부터 얻은 멀티오믹스 데이터를 통합하였다:

1. 비훈련 휴식 (Untrained Rest, UR): $n=94$
2. 비훈련 운동 후 (Untrained Post-Exercise, UE): $n=71$ (고강도 작업 4시간 후)
3. 훈련된 휴식 (Trained Rest, TR): $n=65$ (6개월간의 훈련 후)

데이터 생성 및 처리:

• 전사체학 (Transcriptomics): 골격근(중둔근) 샘플에 대해 RNA-seq를 수행하였다. 리드(reads)는 EquCab3 참조 게놈에 매핑되었으며, 발현량이 정량화되었다.
• 유전체학 (Genomics): 3,231마리의 서러브레드 말로부터 얻은 유전자형 데이터(SNP50K, SNP70K, SNP670K 어레이 사용)를 125마리의 참조 패널을 사용하여 약 750만 개의 상염색체 변이 수준으로 임퓨테이션(imputation)하였다.
• 표현형 (Phenotypes): 경주 거리(평균, 최고, 최상급, 비엘리트, 최고-비엘리트) 및 2세 속도 형질에 대해 혼합 선형 모델(GCTA)을 사용하여 GWAS를 재수행하였다.

분석 프레임워크:

1. eQTL 및 reQTL 매핑: tensorQTL을 사용하여 각 상태에서의 cis-eQTL을 매핑하였다. 반응형 eQTL(reQTL)은 쌍을 이룬 샘플 간(UE vs. UR은 운동 반응, TR vs. UR은 훈련 반응)의 효과 크기를 비교하여 다변량 적응형 수축(mashr) 방법을 통해 식별되었다.
2. 기능적 농축 (Functional Enrichment): reQTL을 포함하는 유전자에 대해 유전자 온톨로지(GO) 및 전사 인자(TF) 농축 분석을 수행하였다.
3. 통합적 인과 추론:
   • TWAS: FUSION 소프트웨어를 사용하여 유전자 발현(cis-eQTL로부터 예측됨)과 GWAS 형질 간의 연관성을 분석하였다.
   • 공국소화 (Colocalisation): Coloc 패키지(SuSi1 모델)를 사용하여 유전자 발현과 경주 형질 사이의 공유된 인과적 변이 존재 여부를 테스트하였다.
   • SMR: 요약 통계 기반 멘델 무작위 배정(SMR)을 채택하였으며, 다표현형성(pleiotropy)과 연관 불평형(LD)을 구분하기 위해 HEIDI 분석을 사용하였다.

주요 결과

• 발현의 유전적 구조:

  • UR, UE, TR 그룹에서 각각 3,044개, 2,285개, 1,716개의 cis-eGenes를 식별하였다.
  • 상위 cis-eQTL은 전사 시작 부위(TSS) 근처에 밀집되어 있었으나, 조건부 독립 신호는 더 먼 곳에 위치하였다. eQTL 효과 크기와 TSS로부터의 거리 사이에는 음의 상관관계가 관찰되었다.
  • reQTL 발견: 948개의 운동 reQTL과 2,366개의 훈련 reQTL이 식별되었다. 정적인 eQTL과 달리, reQTL은 TSS에 대해 더 균일한 분포를 보였으며, 이는 원위 조절 영역(프로모터/인핸서)에 농축되어 있음을 시사한다.
  • 기능적 농축: 운동 및 훈련 reGenes는 대사 과정, 스트레스 반응 및 근육 발달에 유의하게 농축되었다. 특히, reGenes는 비-reGenes에 비해 전사 인자의 비율이 더 높았다.
  • 방향성 효과: 일부 reQTL은 상태 간에 반대되는 방향성 효과를 나타냈다 (예: 운동 중에는 ERCC1 발현을 증가시키지만, 휴식 시에는 감소시키는 변이).

• GWAS 복제 및 검증:

  • 경주 거리에 대한 GWAS는 18번 염색체의 주요 로커스(MSTN에 의해 표지됨)를 확인하였으며, 높은 해상도로 기존 연구 결과를 재확인하였다.
  • 속도 형질의 경우, 전장 유전체 유의한 SNP는 발견되지 않았으나, 8번 염색체의 유의미한 영역이 식별되었다.

• 인과적 유전자 식별:

  • TWAS: 네 개의 유전자(MSTN, ORMDL1, ANKAR, OSGEPL1)가 경주 거리와 연관되어 있었다. 조건부 분석 결과 MSTN이 주요 독립 신호임을 유지하였다.
  • 공국소화: MSTN 및 ORMDL1 eQTL은 경주 거리 GWAS 신호와 공국소화되었다.
  • SMR: MSTN, ANKAR, ORMDL1에 대한 인과 관계가 경주 거리에 대해 추론되었으나, ORMDL1은 엘리트 말 거리 형질에서는 유의성이 부족했다.
  • 속도 형질: 엄격한 유의성 임계치를 충족하는 유전자는 없었으나, 상위 후보로는 DHDH, GPT2, ATAT1, GYS1 등이 포함되었으며, 이들은 모두 에너지 대사와 근육 기능의 생물학적 역할과 관련이 있다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 말의 운동 형질에 대한 유전체, 전사체 및 GWAS 데이터의 첫 번째 종합적인 멀티오믹스 통합을 제공한다고 주장한다. 주요 기여는 다음과 같다:

1. 방법론적 검증: 본 연구는 TWAS, 공국소화, SMR을 결합하여 기능적으로 유의미한 인과적 유전자를 식별하는 유용성을 입증하였으며, 핵심 동력인 MSTN을 성공적으로 재식별함으로써 이를 검증하였다.
2. 기전적 통찰: 유전된 유전적 메커니즘과 운동 및 훈련에 의한 획득된 분자적 반응 사이의 구분을 명확히 하였다. reQTL의 식별은 유전적 변이가 생리적 상태(휴식 vs. 운동 vs. 훈련)에 따라 어떻게 유전자 발현을 차별적으로 조절할 수 있는지를 강조한다.
3. 동물 모델의 유용성: 본 연구는 서러브레드 말을 운동 유전체학 연구를 위한 중요한 모델로서 재확인하며, 이는 인간을 포함한 다른 포유류에도 적용될 수 있는 골격근 적응에 대한 통찰을 제공한다.
4. 새로운 후보군: 속도 형질에 대한 새로운 후보 유전자(GPT2, GYS1, DHDH, ATAT1)를 제시하여, 이들을 특정 대사 경로(TCA 회로, 글리코겐 합성, 미토콘드리아 기능)와 연결하였다.

결론적으로, 본 논문은 이러한 통합적 접근 방식이 특정 유전적 변이가 유전자 발현 조절을 통해 어떻게 운동 능력에 영향을 미치는지에 대한 보다 정밀한 평가를 가능하게 하며, 운동에 따른 골격근의 적응 반응에 대한 새로운 오믹스 통찰을 제공한다고 밝히고 있다.