Bioactivity of crude extract from marine-derived Streptomyces avermitilis BIOTECP1C4 against Staphylococcus aureus: antimicrobial, antibiofilm and antivirulence evaluation

*기술 요약: Staphylococcus aureus에 대한 Streptomyces avermitilis BIOTECP1C4️ 조추출물의 생물 활성*

문제 제기
다제내성(MDR) 병원균인 Staphylococcus aureus를 중심으로 한 전 세계적인 항생제 내성(AMR)의 증가는 의료 체계에 중대한 도전 과제를 제시하고 있다. 이러한 병원균에 의한 바이오필름(생체막) 형성은 항생제의 침투와 효능을 저하시킴으로써 문제를 더욱 악화시킨다. 따라서 반드시 직접적인 살균 압력을 가하지 않더라도, 바이오필름 형성을 억제하고 독성 인자를 교란할 수 있는 새로운 작용 기전을 가진 새로운 항균제 발견이 시급하다. 해양 및 연안 생태계는 독특한 이차 대사산물을 생성할 수 있는 대사 적응력이 뛰어난 미생물의 미개척 저장고로 알려져 있다.

연구 방법
본 연구는 브라질 상 루이스(São Luís)의 연안 모래에서 분리된 해양 유래 방선균 균주인 Streptomyces avermitilis BIOTECP1C4의 생명공학적 잠재력을 조사하였다. 연구는 다음과 같은 다단계 접근 방식을 따랐다:

1. 균주 특성 분석 및 배양: 거시적 및 미세 형태학적 분석(사상형 성장, 나선형 포자 형성)을 통해 균주를 식별하였으며, 감자 데크스트로스 브로스(PDB)에서 15일 동안 침지 발효를 통해 배양하였다. 이차 대사산물은 에틸 아세테이트를 사용하여 상층액으로부터 추출하였다.
2. 항균 스크닝: 참조 균주(S. aureus ATCC 2923, ATCC 25923) 및 임상 혈액 분리주(ICH 9722, ICH 25924, ICH 4201, ICH 1117)를 대상으로 디스크 확산법과 브로스 미량 희석법을 사용하여 최소 억제 농도(MIC)를 결정하였다.
3. 항독성 및 항바이오필름 분석:
   • 스타필록산틴(Staphyloxanthin) 억제: 보호용 카로티노이드 색소 생성을 분광 광도계를 사용하여 아사멸 농도(sub-inhibitory concentrations: ½, ¼, ⅛ MIC)에서 정량화하였다.
   • 바이오필름 억제 및 제거: 폴리스티렌 표면에서 바이오필름 형성을 방지하고 이미 형성된 바이오필름을 제거하는 추출물의 능력을 평가하기 위해 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하였다.
   • 항감염 활성: Tenebrio molitor(밀웜) 유충을 이용한 in vivo 모델을 사용하여, S. aureus 감염 후 추출물 처리에 따른 생존율을 평가하였다.
4. 독성 프로파일링:
   • in vivo: 유충의 생존율을 다양한 추출물 농도에서 모니터링하였다.
   • in vitro: 인간 적혈구를 사용하여 세포 독성을 결정하기 위한 용혈 활성을 평가하였다.
5. 화학적 특성 분석: 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC–MS)을 사용하여 조추출물 내 휘발성 및 반휘발성 화합물을 식별하였다.

주요 결과

• 항균 활성: 조추출물은 중간 정도의 항균 활성을 나타냈다. 저해 구역은 27.5 mm에서 34 mm 사이였다. MIC 값은 균주마다 달랐으며, 가장 민감한 임상 분리주(ICH 9722)의 경우 250 µg/mL였고, ATCC 균주의 경우 1,000 µg/mL였다.
• 항독성 효과: 아사멸 농도에서 추출물 처리는 스타필록산틴 생성을 유의하게 감소시켰으며, 특히 ½ MIC에서 두드러졌는데, 이는 박테리아의 산화 스트레스 방어 기전을 교란함을 시사한다.
• 항바이오필름 활성: 추출물은 균주 의존적인 항바이오필름 효과를 보였다. 추출물은 모든 테스트 농도에서 임상 분리주 ICH 1117 및 ICH 9722의 바이오필름 형성을 유의하게 억제하였다. 참조 균주(ATCC 25923 및 ATCC 29213)의 이미 형성된 바이오필름을 50% 이상 감소시킨 반면, 일부 임상 분리주의 형성된 바이오필름에 대한 효능은 변동성이 컸다. 특히, 분리주 ICH 4201은 아사멸 농도에서 바이오필름 형성이 증가하는 양상을 보였다.
• 독성 및 안전성: T. molitor 유충에서 250 및 500 µg/mL 농도의 추출물은 낮은 독성을 보였으나(생존율 80%), 1,000 µg/mL에서는 생존율이 60%로 떨어졌다. 용혈 분석 결과, ≤250 µg/mL 농도에서는 최소한의 용혈을 보였으나, 고농도에서는 유의한 용혈이 관찰되었다(IC₅₀ 4.254 µg/mL, 단 250 µg/mL 이상의 농도에서 뚜렷한 영향이 나타남).
• 화학적 조성: GC–MS 분석을 통해 벤즈알데히드, 2-메틸이소보르네올, 팔미트산, 올레산, 스테아르산 등을 포함한 25개의 화합물을 식별하였다. 이들 중 여러 성분은 항균, 항산화 및 항바이오필름 활성과 관련이 있다.

의의 및 주장
저자들은 Streptomyces avermitilis BIOTECP1C4가 Staphylococcus aureus에 대해 측정 가능한 항균, 항바이오필름 및 항독성 활성을 가진 조추출물을 생성한다고 결론지었다. 본 연구는 추출물의 능력을 다음과 같이 강조한다:

1. 특정 균주에서 바이오필름 형성을 억제하고 이미 형성된 바이오필름을 파괴함.
2. 스타필록산틴 생성을 감소시켜, 잠재적으로 숙주 환경 내에서 박테리아의 독성과 생존력을 약화시킴.
3. in vivo 및 in vitro 모델 모두에서 최대 250 µg/mL 농도까지 낮은 독성을 나타냄.

본 논문은 팔미트산, 올레산과 같은 지방산 및 벤즈알데히드와 같은 방향족 알데히드의 존재가 이러한 생물학적 효과에 기여할 가능성이 높다고 상정한다. 그러나 저자들은 조추출물이 구체적인 작용 기전을 확인하고 치료적 적용 가능성을 검증하기 위해 추가적인 정제 및 분자적 특성 분석이 필요하다는 점을 강조하며 신중한 입장을 유지하고 있다. 이 연구는 새로운 생물 활성 대사산물의 원천으로서 연안 해양 환경 탐사의 중요성을 뒷받ilst며, 해당 추출물이 임상용으로 즉시 사용 가능하다는 주장은 하지 않는다.