Silencing OTUB1 promotes pyroptosis and M1 macrophages polarization to inhibit HepG2 cell proliferation

기술 요약: OTUB1 억제는 HepG2 세포의 증식을 억제하기 위해 파이롭토시스(Pyroptosis) 및 M1 대식세포 분극화를 촉진한다

문제 제기
간암은 높은 악성도를 보이며 전 세계적으로 높은 사망률을 기록하는 질환이다. 종양 미세환경(TME), 특히 종양 관련 대식세포(TAMs)의 분극화 상태는 암 진행에 결정적인 영향을 미친다. M1 유사 대식세포는 항종양 특성을 보이는 반면, M2 유사 대식세포는 일반적으로 면역 억제 및 종양 촉진 효과를 가진다. 또한, 인플라마좀 의존적 프로그램 세포 사멸의 일종인 파이롭토시스(Pyroptosis)는 종양 생존과 면역 조절에서 이중적인 역할을 수행한다. 탈유비퀴틴화 효소인 OTUB1은 세포 증식 및 면역 회피를 포함한 다양한 종양 과정을 조절하는 것으로 알려져 있으나, 간암 미세환경 내에서 파이롭토시스를 조절하고 그에 따른 대식세포 분극화에 미치는 구체적인 역할은 여전히 불분명하다. 본 연구는 OTUB1의 억제가 HepG2 간암 세포와 THP-1 유래 대식세포의 파이롭토시스를 조절할 수 있는지, 그리고 이러한 변화가 대식세포 분극화와 종양 세포 증식에 어떻게 영향을 미치는지 조사한다.

연구 방법론
본 연구는 HepG2 간암 세포와 THP-1 유래 M0 대식세포를 포함하는 공동 배양 시스템을 활용하였다.

• 세포 모델 및 형질전환: HepG1 세포와 THP-1 세포(PMA를 사용하여 M0 대식세포로 분화됨)에 OTUB1 특이적 siRNA를 형질전환하였다. 형질전환 효율은 면역형광법과 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 검증되었다.
• 공동 배양 시스템: 파라크라인(Paracrine) 상호작용을 연구하기 위해 Transwell 시스템을 사용하여 HepG2 세포와 M0 대식세포를 공동 배양하였다.
• 기능 분석:
  • 증식: CCK-8 분석을 통해 24, 48, 72시간 동안 세포 생존력을 평가하였다.
  • 형태학: 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 파이롭토시스의 형태학적 변화(예: 세포 부종, 막 파열)를 관찰하였다.
  • 단백질 발현: 웨스턴 블롯을 통해 OTUB1, 파이롭토시스 관련 마커(Cleaved-Caspase-1, Cleaved-Caspase-4, GSDMD), 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-18) 및 대식세포 분극화 마커(M1을 위한 CD86, M2를 위한 CD206)의 발현량을 정량화하였다.
  • 상호작용 네트워크: 공동 면역침강법(Co-IP)과 질량 분석법을 결합하여 OTUB1 상호작용 단백질을 식별하고 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하였다.
• 통계 분석: 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 Student's t-test 및 one-way ANOVA로 분석되었다.

주요 결과

1. OTUB1 억제 효율: OTUB1은 형질전환 후 72시간 시점에 HepG2 세포와 M0 대식세포 모두에서 효과적으로 억제되었다.
2. 세포 증식에 미치는 영향:
   • OTUB1 억제는 HepG2 세포와 M0 대식세포 모두의 증식을 유의하게 억제하였다.
   • 공동 배양 시, 대식세포의 존재는 일반적으로 HepG2 증식을 촉진하였다. 그러나 공동 배양 시스템에서 OTUB1을 억제했을 때 이러한 증식 촉진 효과가 역전되어, 비억제 공동 배양 그룹에 비해 HepG2 생존력이 유의하게 감소하였다.
3. 파이롭토시스 유도:
   • TEM 관찰 결과, OTUB1 억제 후 HepG2와 M0 세포 모두에서 전형적인 파이롭토시스 형태(핵 응축, 막 파열, 공포 형성)가 나타났다.
   • 웨스턴 블롯 분석 결과, OTUB1 억제는 두 세포 유형 모두에서 Cleaved-Caspase-1 및 Cleaved-Caspase-4의 수준을 증가시켰다.
   • 흥미롭게도, 억제 그룹에서 세포 내 GSDMD, IL-1β, IL-18 수치는 감소하였다. 저자들은 이를 최종 검출 시간 때문으로 설명하며, 이 단백질들이 후기 단계의 파이롭토시스 과정에서 절단되거나 소비되거나 혹은 세포 외로 방출되었을 가능성을 시사하였다.
   • 억제되지 않은 공동 배양 그룹에서는 HepG2의 파이롭토시스가 억제되었다(낮은 Cleaved-Caspase-1/4, 높은 GSDMD/사이토카인). OTUB1 억제는 이러한 경향을 역전시켜 HepG2 세포의 파이롭토시스 활성화를 촉진하였다.
4. 대식세포 분극화:
   • 공동 배양 단독으로는 M0 대식세포가 M2 표현형(CD206 증가, CD86 감소)으로 분극화되는 것을 유도하였으며, 이는 HepG2 증식 강화와 상관관계가 있었다.
   • OTUB1이 억제된 공동 배양 그룹에서는 대식세포가 M1 표현형(CD86 증가)으로 전환되었으며, 이는 HepG2 증식 억제와 상관관계가 있었다.
5. 단백질 상호작용 네트워크: Co-IP와 질량 분석을 통해 PSMC6, DDX17, LUC7L2, TUFM, RPS14/RPS24, ALDH2, ERP70, ACAA2, PRDX3를 포함한 OTUB1 상호작용 단백질 네트워크를 식별하였다. GO 및 KEKK 분석 결과 산화-환원 과정, 번역 및 간세포암 관련 경로가 풍부하게 나타났다.

의의 및 주장
본 연구는 OTUB1 억제가 다음과 같은 방식으로 간암 미세환경에서 핵심적인 조절 기제로 작용한다고 결론짓는다:

1. 파이롭토시스 촉진: 간암 세포와 대식세포 모두에서 파이롭토시스를 직접적으로 유도한다.
2. 면역 재프로그래밍: 대식세포의 분극화를 종양 촉진형 M2 표현형에서 항종양형 M1 표현형으로 유도한다.
3. 종양 성장 억제: 유도된 파이롭토시스와 M1 분극화의 결여된 결합 효과는 HepG2 세포의 증식을 억제한다.

저자들은 OTUB1이 "파이롭토시스–대식세포 분극화–간암 진행" 축의 핵심 조절자라고 주장한다. 이들은 OTUB1을 표적으로 하는 것이 종양 미세환경을 재구성하기 위한 새로운 면역 치료 전략의 이론적 근거를 제공할 수 있다고 제안한다. 본 연구는 단일 세포주(HepG2)에 대한 의존성, OTUB1과 파이롭토시스를 연결하는 구체적인 분자 기전의 추가 검증 필요성, 그리고 이러한 발견을 확인하기 위한 생체 내(in vivo) 동물 모델의 필요성 등 한계점을 인정하고 있다.