Intensity-based scattering correction enables in vivo two-photon imaging beyond 1 mm

De hersenen zijn een fort van biologisch weefsel, dicht en troebel, wat het kijken diep in het binnenste met licht een enorme uitdaging maakt. Decennialang hebben wetenschappers een krachtige beeldvormingstechniek genaamd twee-fotonenmicroscopie gebruikt om met ongelooflijke helderheid in levende hersenen te kijken. Deze methode gebruikt lichtpulsen om minuscule fluorescerende markers te laten oplichten, waardoor onderzoekers individuele cellen en hun verbindingen kunnen zien. Echter, naarmate het licht dieper reist, kaatst het af op het verstrooiende weefsel van de hersenen, vergelijkbaar met hoe een zaklampstraal diffuus wordt in dikke mist. Deze verstrooiing vervaagt het beeld en verzwakt het signaal, waardoor het zicht van de microscoop effectief gevangen blijft in de bovenste laag van de hersenen, de cortex. Om diepere structuren te zien, zoals de hippocampus, die essentieel is voor het geheugen, moesten onderzoekers er traditioneel voor kiezen om over te stappen op nog complexere en duurdere drie-fotonenmicroscopen of langere golflengten van licht te gebruiken die moeilijker te genereren zijn.

Een team van onderzoekers aan de Universiteit van Californië, Davis, heeft nu een manier gevonden om de grenzen van standaard twee-fotonenmicroscopen veel dieper dan voorheen te verleggen. Ze ontwikkelden een nieuwe methode genaamd DeepFOCUS, die gebruikmaakt van een vorm van kunstmatige intelligentie, niet om een wazig beeld achteraf te corrigeren, maar om het licht te vormen voordat het de hersenen zelfs maar binnendringt. Door in realtime een specifiek patroon van lichtintensiteit te berekenen, compenseert het systeem voor het verstrooiende weefsel, waardoor het licht zelfs een millimeter of meer onder het oppervlak scherp kan focussen. Deze doorbraak betekent dat bestaande twee-fotonenmicroscopen, die algemeen voorkomen in neurowetenschappelijke laboratoria, potentieel kunnen worden geüpgraded om diepe hersenstructuren te zien zonder de noodzaak voor volledig nieuwe, gespecialiseerde hardware.

De kern van deze prestatie ligt in de manier waarop de onderzoekers de chaos van lichtverstrooiing aanpakken. Wanneer licht door de hersenen gaat, raakt het verstrooid, en komen de fotonen in wanorde aan bij het doelwit. Traditionele methoden proberen deze verstrooiing te herstellen door de vervorming te meten en een tegenvervorming toe te passen, maar dit faalt vaak in diep weefsel omdat het signaal te zwak wordt om nauwkeurig te meten. Het DeepFOCUS-team nam een andere aanpak. In plaats van te proberen de golffront van het licht om te keren, richtten zij zich op de intensiteit, of de helderheid, van het licht. Ze gebruikten een digitale micromirrorspiegel-apparaat (digital micromirror device), een chip bedekt met duizenden piepkleine spiegeltjes, om willekeurige lichtpatronen op de hersenen te projecteren. Terwijl deze patronen het weefsel raken, zouden sommige delen van het licht constructief interfereren, wat een helderdere plek creëert, terwijl andere delen elkaar zouden opheffen.

Het systeem mat vervolgens de resulterende gloed van de fluorescerende markers in de hersenen. Een lichtgewicht, zelfgesuperviseerd neuraal netwerk analyseerde deze helderheidsmetingen om te bepalen welke specifieke spiegels op de chip ingeschakeld moesten worden om het meest effectieve lichtpatroon te creëren. Dit netwerk vertrouwde niet op een vooraf getrainde database van afbeeldingen; in plaats daarvan leerde het direct van de specifieke verstrooiingsomstandigheden van de hersenen waar het op dat moment naar keek. Zodra het netwerk het beste patroon had geïdentificeerd, projecteerde het dat patroon op de hersenen, waardoor het licht fysiek werd gevormd om door het verstrooiende weefsel heen te snijden en scherp te focussen op het doelwit. Dit proces vindt in realtime plaats, waardoor de microscoop kan scannen en het beeld kan corrigeren terwijl het beweegt.

De onderzoekers testten dit systeem op levende muizen, waarbij ze door de volledige dikte van de cortex van de hersenen en het sterk verstrooiende witte stof daaronder beeld vormden. Zonder de correctie werden de beelden van bloedvaten en neuronen onduidelijk en vervaagden ze snel naarmate de microscoop dieper ging. Met DeepFOCUS slaagde het team erin om fluorescerende bloedvaten tot een diepte van 1,1 millimeter in beeld te brengen en individuele neuronen in de hippocampus te visualiseren op een diepte van 1,2 millimeter. Op deze dieptes onthulden de gecorrigeerde beelden fijne details, zoals minuscule haarvaten en de delicate vertakkingen van neuronen, met een helderheid die voorheen onmogelijk was met standaard twee-fotonenmicroscopie bij de gebruikte golflengte. Het systeem bereikte dit door de hersenen in kleine subregio's te verdelen en voor elk gebied een uniek correctiepatroon te berekenen, waardoor het licht scherp bleef focussen, zelfs wanneer de verstrooiingseigenschappen over verschillende gebieden van de hersenen veranderden.

Dit werk demonstreert dat de dieptelimiet van twee-fotonenmicroscopie geen vaste barrière is, maar een uitdaging die overwonnen kan worden met slimmere lichtcontrole. De onderzoekers toonden aan dat door een neuraal netwerk te gebruiken om de juiste intensiteitspatronen te berekenen, zij signalen konden herstellen van dieptes die voorheen alleen toegankelijk waren met complexere drie-fotonensystemen. De methode werkt door het excitatie licht fysiek te vormen om het signaal te versterken, in plaats van te proberen een gedegradeerd beeld digitaal te herstellen nadat het is gemaakt. Dit onderscheid is cruciaal omdat het het risico vermijdt op het creëren van valse details, of "hallucinaties", die kunnen optreden wanneer software probeert te raden hoe een wazig beeld eruit zou moeten zien. In plaats daarvan valideert het systeem elke correctie door de werkelijke fluorescentie te meten die het produceert.

De implicaties voor de neurowetenschap zijn aanzienlijk. De hippocampus is een regio die cruciaal is voor leren en geheugen, maar het is moeilijk om dit in levende dieren te bestuderen zonder invasieve procedures. Door hoogwaardige beeldvorming van deze diepe structuur in een intacte hersen te mogelijk maken, opent DeepFOCUS nieuwe deuren voor het observeren van hoe neurale circuits in realtime functioneren. De onderzoekers merkten op dat hun systeem geïmplementeerd kan worden door bestaande twee-fotonenmicroscopen te upgraden met een digitale micromirrorspiegel-apparaat en de benodigde software, waardoor diepe hersenbeeldvorming toegankelijker wordt voor laboratoria wereldwijd. Hoewel de techniek nog niet de absoluut diepste grenzen van de hersenen bereikt, verschuift het de grens van wat mogelijk is met standaardapparatuur, door te bewijzen dat diep weefselbeeldvorming kan worden bereikt door intelligente manipulatie van lichtintensiteit in plaats van alleen brute kracht of complexere hardware.

De studie evalueerde ook zorgvuldig de parameters van hun systeem om de robuustheid te waarborgen. Ze testten hoe het aantal gebruikte lichtpatronen voor de detectie de kwaliteit van de correctie beïnvloedde, en vonden dat een specifiek aantal metingen een betrouwbare balans bood tussen snelheid en nauwkeurigheid. Ze optimaliseerden ook de structuur van het neurale netwerk en bepaalden de ideale grootte van de interne verwerkingseenheden om de gegevens efficiënt te verwerken zonder onnodige complexiteit. Deze tests bevestigden dat het systeem zich kon aanpassen aan verschillende verstrooiingsomstandigheden en een hoge prestatie kon behouden over verschillende dieptes en weefseltypen. De resultaten waren consistent en lieten substantiële verbeteringen in beeldhelderheid en -duidelijkheid zien, waarbij sommige gebieden een bijna zesvoudige verbetering in signaalsterkte vertoonden.

Uiteindelijk biedt dit onderzoek een praktisch pad voor het bestuderen van de diepe hersenen. Het overbrugt de kloof tussen de mogelijkheden van de huidige twee-fotonentechnologie en de behoeften van neurowetenschappers die toegang nodig hebben tot subcorticale regio's. Door het probleem van verstrooiing te veranderen in een oplosbare puzzel voor een neuraal netwerk, heeft het team een instrument geleverd dat zowel krachtig als aanpasbaar is. Het vermogen om diep in de levende hersenen te kijken met subcellulaire resolutie, met een methode die compatibel is met bestaande laboratoriumopstellingen, vertegenwoordigt een betekenende stap naar het begrijpen van de complexe werking van de hersenen in gezondheid en ziekte. Het werk staat als een testament voor de kracht van het combineren van optische fysica met moderne computationele methoden om langdurige biologische uitdagingen op te lossen.