Evidence of off-target probe binding affecting 10x Genomics Xenium gene panels compromise accuracy of spatial transcriptomic profiling

Deze studie introduceert het softwaretool OPT om off-target binding in 10x Genomics Xenium-pools te detecteren, en toont aan dat dergelijke binding de nauwkeurigheid van ruimtelijke transcriptoomprofielen kan verstoren door expressiepatronen te vermengen met die van niet-doelwitgenen.

De kern

🕵️‍♂️ De Verkeerde Brievenbus: Waarom de Xenium-technologie soms de verkeerde buren bezoekt

Stel je voor dat je een zeer geavanceerde postbezorger hebt die in een enorme stad (je lichaam) woont. Deze postbezorger, die 10x Genomics Xenium heet, heeft de taak om heel specifieke brieven (genen) te vinden en te tellen in elke afzonderlijke woning (cel). Hij doet dit met een speciale sleutel (de probe). Als de sleutel perfect past in het slot van de juiste deur, telt hij de brief.

Het probleem? Soms past die sleutel niet alleen in de juiste deur, maar ook in de deuren van de buren die er heel erg op lijken. De postbezorger denkt dan: "Aha, dit is de juiste brief!" en telt hem mee. Maar dat is een verkeerde brief.

Dit artikel van onderzoekers van de Johns Hopkins University vertelt ons dat bij de Xenium-technologie dit "verkeerde tellen" vaker gebeurt dan gedacht, en dat dit de resultaten kan verstoren.

1. De Uitvinding: De "OPT"-detective

De onderzoekers hebben een nieuwe digitale detective bedacht, genaamd OPT (Off-target Probe Tracker).

• Hoe werkt het? OPT neemt de ontwerpen van alle sleutels (de 2.582 probes) die door 10x Genomics zijn gemaakt.
• Het onderzoek: De detective kijkt in een enorme telefoonboek (het menselijk genoom) om te zien of deze sleutels per ongeluk ook in andere deuren passen.
• De ontdekking: Ze vonden dat bij minstens 14 van de 313 genen in hun testset, de sleutels ook in de deuren van andere genen pasten. Het is alsof de sleutel voor "Huis 10" ook open zou gaan bij "Huis 11" en "Huis 12", omdat de nummers op de deuren bijna hetzelfde zijn.

2. Het Bewijs: Twee camera's op dezelfde foto

Om te bewijzen dat dit echt een probleem is, keken de onderzoekers naar dezelfde tumorweefsel op twee verschillende manieren:

1. Xenium: De dure, snelle technologie die de sleutels gebruikt.
2. Visium & scRNA-seq: Andere, heel nauwkeurige methoden die werken als een "fotokopie" van de inhoud van de cellen, zonder die specifieke sleutels.

Het resultaat was opvallend:

• Voor de meeste genen zagen beide methoden hetzelfde.
• Maar voor sommige genen (zoals APOBEC3B) zag de Xenium-technologie een enorme hoeveelheid brieven, terwijl de andere methoden ze niet eens zagen.
• De oplossing van de detective: Toen de onderzoekers keken naar de "buren" (de genen waar de sleutel per ongeluk ook in paste), zagen ze dat die buren wel degelijk veel brieven hadden.
• Conclusie: De Xenium-technologie telde de brieven van de eigenaar én de buren bij elkaar op. Het was alsof je de post van drie huizen in één hokje gooide en dacht dat het allemaal van één huis kwam.

3. Waarom is dit belangrijk?

Stel je voor dat je een arts bent die een ziekte probeert te diagnosticeren door te kijken hoeveel "brandblussers" (een specifiek gen) er in een stad zijn.

• Als de postbezorger per ongeluk ook de brandblussers van de buren meetelt, denk je dat er meer brandgevaar is dan er echt is.
• Dit kan leiden tot verkeerde conclusies in onderzoek en misschien zelfs in de toekomst in de medische diagnose.

4. Wat doen de onderzoekers nu?

Ze hebben een gratis software-tool (OPT) gemaakt die elke wetenschapper kan gebruiken.

• Voor de toekomst: Als je een nieuw experiment plant, kun je deze tool eerst laten draaien. Hij zegt dan: "Pas op! Je sleutel past ook in die andere deur. Kies een betere sleutel."
• Voor het verleden: Als je al data hebt, kun je nu controleren of je resultaten misschien "vervuild" zijn door deze verkeerde metingen.

Samenvattend in één zin:

Deze studie waarschuwt dat de dure Xenium-technologie soms per ongeluk de verkeerde genen meetelt omdat de "sleutels" niet 100% uniek zijn, en biedt een gratis hulpmiddel om dit in de toekomst te voorkomen, zodat we de juiste "brieven" in de juiste "huizen" vinden.

Technische samenvatting

Probleemstelling

De nauwkeurigheid van ruimtelijke gen-expressieprofielen gegenereerd door op probes gebaseerde in situ transcriptomietechnologieën, zoals 10x Genomics Xenium, is afhankelijk van de specificiteit waarmee probes binden aan hun beoogde doelwitgen. Het artikel definieert off-target binding als het fenomeen waarbij een probe bindt aan een RNA-sequentie die niet overeenkomt met het beoogde doelwitgen.

Omdat het ligatie- en versterkingsproces (Rolling Circle Amplification of RCA) na binding niet kan onderscheiden tussen on-target en off-target binding, leidt off-target binding tot een vervorming van de kwantificering van de genexpressie. De waargenomen expressie vertegenwoordigt dan een som van de expressie van het doelwitgen én het off-target gen. Dit kan leiden tot misleidende biologische conclusies, vooral bij genen die deel uitmaken van grote genfamilies met hoge sequentiehomologie (paralogen).

Methodologie

De auteurs hebben een nieuwe softwaretool ontwikkeld en deze toegepast op bestaande datasets om off-target binding te voorspellen en te valideren:

1. Ontwikkeling van OPT (Off-target Probe Tracker):

   • Een Python-tool die de aligner nucmer gebruikt om probe-sequenties (40bp) uit te lijnen tegenover geannoteerde transcriptomen.
   • De tool kan worden geconfigureerd om perfect sequentiehomoologie te eisen of om imperfecte matches toe te staan aan de uiteinden van de probe (om rekening te houden met ligatie-eisen waarbij mismatches aan de uiteinden mogelijk nog binding toelaten).
   • OPT analyseert of een probe perfect (of met toegestane mismatchen) aligneert met transcripten van andere genen dan het beoogde doelwit.

2. Toepassing op Referentie-annotaties:

   • De tool werd toegepast op het 10x Genomics Xenium Human Breast Gene Panel (313 genen, 2.582 probes).
   • Analyse werd uitgevoerd met meerdere menselijke genoomannotaties: GENCODE v47, RefSeq v110 en CHESS v3.1.3.
   • De focus lag op off-target binding naar eiwitcoderende genen, aangezien dit de meest biologisch relevante en expressieve categorie is.

3. Experimentele Validatie met Orthogonale Data:

   • Om de voorspellingen te valideren, werden ruimtelijke en single-cell data van hetzelfde borstkankerweefsel vergeleken:
     • Xenium: De target-technologie (single-cell resolutie, probe-gebaseerd).
     • Visium CytAssist: Een sequentie-gebaseerde ruimtelijke technologie (55µm spots) als orthogonale validatie.
     • 3' scRNA-seq: Single-cell RNA-sequencing van hetzelfde weefselblok.
   • De auteurs gebruikten STalign om de ruimtelijke data van Xenium en Visium op elkaar af te stemmen en Harmony om batch-effecten tussen Xenium en scRNA-seq te verwijderen voor een gezamenlijke UMAP-embedding.
   • Validatiestrategie: Voor genen met voorspelde off-target binding werd de expressie van het doelwitgen in Xenium vergeleken met de geaggregeerde expressie van het doelwitgen plus de voorspelde off-target genen in de Visium/scRNA-seq data.

4. Toepassing op Aangepaste Panels:

   • De tool werd ook toegepast op aangepaste panels van het HuBMAP-consortium (placenta en multi-orgaan panelen) en de impact beoordeeld door expressie in tissue-specifieke RNA-seq referentie-atlassen te integreren.

Belangrijkste Resultaten

• Voorspelling van Off-target Binding:

  • Bij strikte perfect sequentiehomoologie (GENCODE v47) identificeerde OPT off-target binding voor 37 genen (121 probes).
  • Na filtering voor alleen eiwitcoderende genen en het nemen van de unie over drie annotaties (GENCODE, RefSeq, CHESS), bleven 14 genen over die potentieel beïnvloed zijn door off-target binding naar eiwitcoderende genen (bijv. APOBEC3B, TPSAB1, CD8B, S100A4).
  • Toelating van mismatchen aan de uiteinden van de probes (10bp padding) onthulde 18 extra genen met potentieel off-target binding.

• Validatie via Visium en scRNA-seq:

  • Voor genen zonder voorspelde off-target binding (bijv. MS4A1) toonden Xenium, Visium en scRNA-seq een sterke ruimtelijke en cellulaire correlatie (hoge Pearson correlatie, lage RMSE).
  • Voor genen met voorspelde off-target binding (bijv. APOBEC3B) was er een discrepantie: APOBEC3B werd hoog geëxprimeerd in Xenium, maar niet of nauwelijks in Visium en scRNA-seq.
  • Cruciaal: De ruimtelijke en cellulaire expressiepatronen van APOBEC3B in Xenium kwamen sterk overeen met de geaggregeerde expressie van APOBEC3B plus zijn voorspelde off-targets (APOBEC3D en APOBEC3F) in de Visium en scRNA-seq data. Dit bevestigt dat het Xenium-signaal een mix is van het doelwit en de paralogen.

• Impact op Aangepaste Panels:

  • In de HuBMAP custom panels werden tientallen genen geïdentificeerd met off-target binding.
  • De impact varieerde per weefseltype, afhankelijk van of de off-target genen in dat specifieke weefsel ook daadwerkelijk tot expressie kwamen.

• Annotatie-Variabiliteit:

  • De resultaten varieerden aanzienlijk tussen GENCODE, RefSeq en CHESS, voornamelijk door verschillen in annotatie van pseudogenen en lncRNA's. Dit benadrukt het belang van het gebruik van meerdere annotaties voor probe-validatie.

Bijdragen en Significatie

1. Software Tool (OPT): De publicatie introduceert Off-target Probe Tracker (OPT), een open-source tool die onderzoekers in staat stelt om probe-sequenties te valideren op specificiteit voordat of na experimenten, rekening houdend met verschillende annotaties en mismatch-tolerantie.
2. Kritische Validatie van Commercial Platforms: Het artikel levert bewijs dat de pre-designed panels van een marktleider (10x Genomics) gevoelig kunnen zijn voor off-target binding, wat de interpretatie van bestaande datasets (zoals de Janesick et al. studie) kan beïnvloeden. Het benadrukt dat een hoge totale correlatie tussen technologieën niet garandeert dat individuele genmetingen accuraat zijn.
3. Aanbevelingen voor Probe Design en Data-analyse:
   • Auteurs raden aan om probes met voorspelde off-target binding naar eiwitcoderende genen te vermijden of met grote voorzichtigheid te interpreteren.
   • Voor bestaande data wordt geadviseerd om off-target voorspellingen te integreren (bijv. door expressie te aggregeren met off-targets bij cross-platform integratie) en deze genen niet te gebruiken voor het trainen van foundation modellen om foutpropagatie te voorkomen.
4. Transparantie en Reproduceerbaarheid: Het artikel pleit sterk voor de openbaarmaking van probe-sequenties door commerciële vendors. Zonder deze sequenties is het voor de wetenschappelijke gemeenschap onmogelijk om de specificiteit van de metingen onafhankelijk te verifiëren.

Conclusie:
Dit onderzoek onderstreept dat off-target binding een significante, maar vaak over het hoofd geziene bron van fouten is in probe-gebaseerde ruimtelijke transcriptomics. Door het gebruik van OPT en orthogonale validatie kunnen onderzoekers de biologische interpretatie van hun data verbeteren en de reproduceerbaarheid van ruimtelijke transcriptomics onderzoek waarborgen.