A high throughput platform for measuring and predicting vitrification behavior in multicomponent aqueous solutions

Deze studie introduceert een hoogdoorvoerkundig 384-wells-platform dat de bepaling van de vitrificatiedrempel in complexe waterige oplossingen met ongeveer 50-voud versnelt, waardoor een voorspellend mengselmodel kan worden ontwikkeld voor het rationeel ontwerpen van minder toxische cryobeschermende formuleringen.

De kern

Een snellere manier om vloeibaar glas te maken: Hoe wetenschappers organen voor de toekomst bewaren

Stel je voor dat je een heel complex apparaat, zoals een menselijk hart of een nier, wilt "bevriezen" om het later weer te kunnen gebruiken. Het probleem is dat water in die organen ijskristallen vormt als het bevriest. Die kristallen zijn als kleine, scherpe ijsnaaldjes die de cellen kapot prikken. Om dit te voorkomen, gebruiken wetenschappers een soort "antivries" (cryoprotectanten of CPA's). Maar hier zit de twist: je moet precies de juiste hoeveelheid antivries toevoegen.

• Te weinig? Het vormt ijs en het orgaan is kapot.
• Te veel? De antivries zelf is giftig en vergiftigt het orgaan.

De kunst is dus om de minimale hoeveelheid antivries te vinden die net genoeg is om ijs te voorkomen, maar niet genoeg om giftig te zijn. Dit punt noemen ze de Cv (concentratie voor vitrificatie).

Het oude probleem: Een slakkenrace
Vroeger was het vinden van dit juiste punt een enorme, saaie klus. Wetenschappers moesten duizenden buisjes met verschillende mengsels één voor één in vloeibare stikstof gooien en kijken of er ijs ontstond. Het was alsof je probeert de perfecte temperatuur voor een cake te vinden door duizenden cakes één voor één in de oven te doen, er één uit te halen, te proeven, en dan pas de volgende te maken. Het duurde jaren om maar een paar opties te testen.

De nieuwe uitvinding: Een 384-koppige koers
De onderzoekers van deze paper hebben een revolutionaire nieuwe manier bedacht. Ze hebben een platform ontwikkeld dat werkt als een automatische, razendsnelle testbaan:

1. De Robot-kok: In plaats van mensen die met pipetten werken, doet een robotarm het zware werk. Deze robot kan in een paar uur honderden verschillende mengsels maken in een plaatje met 384 kleine putjes (net zoals een eitjesdoos, maar dan met heel veel vakjes).
2. De Snelheidsrace: Ze gebruiken een slimme "zoekstrategie" (zoals het raden van een getal tussen 1 en 100 door telkens het midden te kiezen). In plaats van elke stap te testen, springt de robot slim naar het juiste punt toe.
3. De Camera: Na het bevriezen kijkt een camera naar de plaatjes. Een computerprogramma scant direct of er ijs (witte vlekjes) of glas (helder) te zien is.

Het resultaat?
Wat vroeger een jaar duurde, doen ze nu in één week. Ze hebben de snelheid met ongeveer 50 keer verhoogd! Het is alsof je van een fiets op een Formule 1-auto bent gestapt.

Interessante ontdekkingen op de weg
Met deze nieuwe snelle methode hebben ze een paar verrassende dingen ontdekt:

• De deksel is cruciaal: Ze merkten dat als ze de plaatjes open lieten, er meer ijs ontstond. Als ze ze afdekten met een siliconen matje (alsof je een kom met soep afdekt), was er minder ijs nodig om het glas te maken. Het lijkt erop dat vocht in de lucht als een "ijskristal-makker" werkt. Een afgesloten omgeving is dus veiliger.
• Grotere moleculen zijn sterker: Ze ontdekten dat grotere antivries-moleculen beter werken dan kleine. Het is alsof je een muur bouwt: met grote stenen heb je er minder van nodig om de muur (de ijsvorming) tegen te houden dan met kleine kiezelsteentjes.
• De perfecte mix: Ze hebben een wiskundig model gemaakt dat voorspelt hoe goed een mengsel werkt, zelfs als je zeven verschillende antivriesmiddelen door elkaar gooit. Dit helpt hen om de perfecte, niet-giftige mix te vinden.

Waarom is dit belangrijk?
Deze technologie opent de deur voor het bewaren van menselijke organen voor transplantatie. Vandaag de dag kunnen we alleen kleine weefsels of hele kleine organen (zoals konijnen- of rattennier) invriezen. Mensenorganen zijn te groot en koelen te langzaam af, waardoor er te veel ijs ontstaat.

Met deze nieuwe, snelle manier om de perfecte antivries-mix te vinden, hopen ze binnenkort menselijke organen veilig te kunnen "bevriezen" en later weer te "ontdooien" zonder schade. Het is een enorme stap richting het oplossen van het tekort aan donororganen en het mogelijk maken van langdurige ruimte-reizen voor mensen.

Kortom: Ze hebben een slimme, snelle robot-methode bedacht om de perfecte "ijs-blokkade" te vinden, zodat we in de toekomst organen kunnen opslaan alsof ze in een tijdloze koelkast liggen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Cryopreservatie van complexe systemen, zoals menselijke organen, staat voor een fundamentele uitdaging: het voorkomen van ijsvorming tijdens het afkoelen zonder dat de concentratie aan cryoprotectieve middelen (CPA's) toxisch wordt.

• De bottleneck: Menselijke organen koelen trager af dan kleine weefsels, wat hogere CPA-concentraties vereist om ijsvorming te onderdrukken (vitrificatie). Huidige methoden om de minimale vitrificatieconcentratie ($C_v$) te bepalen, zijn handmatig, tijdrovend en hebben een lage doorvoer (low-throughput).
• Huidige beperking: De grootste gepubliceerde dataset voor $C_v$ bevat slechts 45 CPA-oplossingen. Dit beperkt de ontdekking van nieuwe, minder toxische formuleringen aanzienlijk, aangezien er miljoenen potentiële kleine moleculen beschikbaar zijn die nog niet zijn getest. Er ontbreekt een hoogdoorvoermethode om de stabiliteit tegen ijsvorming op grote schaal te screenen.

Methodologie

De auteurs hebben een geautomatiseerd, hoogdoorvoersplatform ontwikkeld dat gebaseerd is op 384-well platen. De kerncomponenten van de methode zijn:

1. Geautomatiseerde vloeistofbehandeling: Een Hamilton Microlab STAR-robot bereidt CPA-mengsels voor in 96-well platen en dispenseert deze in drie 384-well platen. Een aangepast script zorgt voor willekeurige verdeling om positionele bias te minimaliseren.
2. Cryogene koelapparatuur: Een aangepast koelplatform met aluminium blokken en vloeibare stikstof koelt de platen. Een acryllaag onder de platen vertraagt het afkoelproces om afkoelsnelheden te simuleren die relevant zijn voor menselijke organen (ongeveer 2,0 °C/min).
3. Binair zoekalgoritme: In plaats van lineair te scannen door concentraties, wordt een binaire zoekstrategie gebruikt. Dit reduceert het aantal benodigde experimenten om $C_v$ te bepalen van 33 metingen naar slechts 5 iteraties per formulering.
4. Beeldanalyse: Na het koelen worden plaatfoto's gemaakt. Een aangepast Python-script analyseert de RGB-intensiteit en variatie per well om automatisch te classificeren of een well is bevriest (ijs) of vitrificeerd (glas).
5. Omgevingscondities: Er werd getest onder verschillende omstandigheden: open platen, platen afgedekt met siliconenmatten, en platen met argon-purging, om het effect van luchtvochtigheid en ijsnucleatie aan het oppervlak te onderzoeken.

Belangrijkste Bijdragen

• Doorvoerverhoging: Het platform verhoogt de doorvoer met ongeveer 50-voud ten opzichte van traditionele buismethoden. Een jaar aan metingen kan nu in één week worden uitgevoerd.
• Data-generatie: Er zijn ongeveer 400 unieke $C_v$-metingen gegenereerd op basis van circa 26.000 individuele datapunten, wat een ongeëvenaarde dataset vormt voor dit veld.
• Voorspellend model: De auteurs hebben een eenvoudig mengselmodel ontwikkeld dat de $C_v$ voor complexe mengsels (tot wel zeven CPA's) voorspelt op basis van de intrinsieke ijs-onderdrukkende eigenschappen ($\alpha$) van de individuele componenten.
• Validatie: De methode is gevalideerd tegen klassieke 15-mL buisexperimenten en historische data (Fahy et al.), waarbij een sterke correlatie ($R^2 > 0,98$) werd gevonden.

Resultaten

1. Invloed van omgevingscondities:
   • Afgesloten platen (met siliconenmatten) vertoonden een lagere $C_v$ dan open platen. Dit suggereert dat waterdamp in de lucht boven de platen ijsnucleatie bevordert, waardoor hogere CPA-concentraties nodig zijn in open systemen.
2. Moleculair gewicht en ijsonderdrukking:
   • Er is een duidelijke omgekeerde relatie gevonden tussen het moleculair gewicht van de CPA en de benodigde molaire concentratie ($C_v$ in mol/L). Grotere moleculen onderdrukken ijsvorming effectiever per molecuul.
   • In massaconcentratie (% w/v) was de variatie echter kleiner, wat aangeeft dat de effectiviteit meer afhankelijk is van het aantal moleculen dan van de totale massa.
3. Anomalieën bij enkelvoudige CPA's:
   • Enkele CPA-oplossingen (zoals 2-Methoxyethanol en Acetamide) vertoonden afwijkend gedrag door de vorming van niet-ijs kristallijne fasen (zoals hydraten). Dit benadrukt dat mengsels vaak robuuster zijn dan zuivere oplossingen.
4. Voorspellend vermogen van het model:
   • Het mengselmodel voorspelde $C_v$-waarden zeer nauwkeurig voor tweecomponentenmengsels ($R^2 = 0,978$) en voor complexere mengsels met meer dan twee componenten ($R^2 = 0,945$).
   • Het model kon ook worden gebruikt om gepubliceerde toxiciteitsdata te evalueren. Hieruit bleek dat veel bestaande studies CPA's testten bij concentraties die ver afstonden van hun daadwerkelijke vitrificatiedrempel, wat leidt tot misleidende toxiciteitsvergelijkingen.

Betekenis en Toekomstperspectief

Deze studie biedt een fundamenteel raamwerk voor de rationele ontwerping van CPA-formuleringen.

• Versnelling van ontdekking: Door de doorvoer drastisch te verhogen, kan nu een veel bredere chemische ruimte worden verkend voor het vinden van nieuwe, minder toxische cryoprotectanten.
• Rationeel ontwerp: Het voorspellende model stelt onderzoekers in staat om formuleringen te ontwerpen die net boven de vitrificatiedrempel liggen, maar onder de toxiciteitsdrempel, wat cruciaal is voor de toepassing in menselijke organen.
• Standaardisatie: De studie benadrukt het belang van gecontroleerde omgevingscondities (afsluiten van platen) voor reproduceerbare resultaten, een factor die vaak wordt genegeerd in eerdere studies.

Samenvattend vult dit werk een kritieke lacune in de cryobiologie op door een schaalbare, geautomatiseerde oplossing te bieden voor het bepalen van vitrificatie-eigenschappen, wat een essentiële stap is richting de succesvolle cryopreservatie van menselijke organen.