Scaling-Up Vertical-Wheel Bioreactors Based on Cell Aggregate Exposure to Shear Stress and Energy Dissipation Rate

Dit onderzoek toont aan dat het schalen van verticale-wiel-bioreactoren voor menselijke pluripotente stamcellen het beste kan gebeuren op basis van de trajectgebaseerde blootstelling van celaggregaten aan energie-dissipatie, in plaats van op volumegemiddelde waarden of schuifspanning.

De kern

Titel: Hoe je duizenden stemcellen veilig laat groeien: Een reis door een draaiende molen

Stel je voor dat je een enorme stad moet bouwen, maar in plaats van bakstenen gebruik je levende, kwetsbare cellen. Deze cellen, stamcellen, zijn de bouwstenen voor de geneeskunde van de toekomst. Ze kunnen veranderen in hartspiercellen om een beschadigd hart te repareren. Maar om een enkel hart te herstellen, heb je niet één of twee cellen nodig, maar wel een miljard. Hoe bouw je die enorme stad zonder de bouwstenen te breken?

Dit is precies het probleem dat de auteurs van dit artikel proberen op te lossen. Ze kijken naar een speciale machine: een verticale wielturbine-bioreactor.

De Machine: Een Draaiende Molen

Stel je een grote emmer voor met daarin een groot, verticaal draaiend wiel (zoals een watermolen). In deze emmer zweven de cellen in een vloeistof. Het doel is om het wiel te laten draaien zodat de cellen goed gemengd worden, zuurstof krijgen en zich kunnen vermenigvuldigen.

Maar hier zit de valkuil:

• Draai je het wiel te langzaam? Dan zakken de cellen naar de bodem, klonteren ze samen tot een grote klomp en stikken ze.
• Draai je het wiel te snel? Dan worden de cellen als kleine balletjes in een wasmachine geslingerd. De kracht van het water (de schuifkracht) is dan zo groot dat de cellen uit elkaar worden gereten of beschadigd raken.

De kunst is om de perfecte snelheid te vinden.

Het Probleem met de oude regels

Vroeger dachten wetenschappers: "Als we in een grote emmer (500 ml) hetzelfde doen als in een kleine emmer (100 ml), gaat het wel goed." Ze keken naar gemiddelden.

• Vergelijking: Het is alsof je zegt: "De gemiddelde temperatuur in dit land is 20 graden, dus iedereen heeft het prettig." Maar in werkelijkheid is het in de bergen vriest het en in de vallei is het 30 graden. Als je een plantje in de vallei zet, verbrandt het, ook al is de gemiddelde temperatuur prima.

De auteurs van dit artikel zeggen: "Nee, we moeten kijken naar wat de cellen echt meemaken tijdens hun reis."

De Nieuwe Methode: Een Reisverslag

In plaats van alleen naar de gemiddelde snelheid van het water te kijken, hebben de wetenschappers een slimme truc bedacht. Ze hebben in de computer (een simulatie) duizenden kleine "spionnen" (die cellen voorstellen) door de emmer laten zwemmen.

Ze hebben gekeken:

1. Waar gaan ze naartoe? (Blijven ze boven drijven of zakken ze naar de bodem?)
2. Hoe hard wordt ze geslingerd? (Hoeveel kracht voelen ze op elk moment?)

Ze ontdekten dat cellen van verschillende grootte heel anders reizen:

• Kleine cellen (zoals kleine druppels) worden makkelijk meegevoerd door de stroming. Ze zwemmen overal rond, ook in rustige hoekjes.
• Grote cellen (zoals zware stenen) zakken sneller naar de bodem en worden harder tegen het draaiende wiel geslingerd. Ze voelen veel meer kracht dan de kleine cellen, zelfs als de machine op dezelfde snelheid draait.

De Belangrijkste Ontdekkingen

De onderzoekers hebben dit getest met echte cellen in de lab en vergeleken met hun computermodellen. Hier is wat ze vonden, vertaald naar alledaagse taal:

1. De "Energie-kracht" (EDR) is de sleutel:
   Er is een maatstaf die aangeeft hoeveel energie het water verliest aan wrijving (de EDR). Dit bleek de belangrijkste factor te zijn. Als de cellen te veel van deze energie-kracht voelen, groeien ze niet goed of sterven ze.

   • Analogie: Denk aan het lopen op een strand. Als het water rustig is, loop je makkelijk. Als de golven te hoog zijn, word je omver gewaaid. De cellen hebben een "golfgrootte" nodig die net goed is om te groeien, maar niet om te vallen.

2. Snelheid is niet alles:
   Je kunt niet zomaar zeggen: "Draai in de grote emmer 2 keer zo snel als in de kleine emmer." Omdat de cellen in de grote emmer zwaarder zijn (of anders bewegen), voelen ze een heel andere kracht, zelfs als de snelheid hetzelfde lijkt.

   • Conclusie: Wat goed werkt in een kleine emmer, werkt niet automatisch in een grote emmer als je alleen naar de snelheid kijkt. Je moet kijken naar de reis die de cellen maken.

3. De perfecte snelheid:
   Ze vonden dat een snelheid van 40 toeren per minuut (rpm) in de kleine emmer het beste was. De cellen groeiden het snelst en vormden de juiste klompjes. Als je te snel draaide (60 rpm), werden de cellen te veel gestrest. Als je te langzaam draaide (30 rpm), vormden ze te grote klompen.

Waarom is dit belangrijk?

Dit onderzoek is als een GPS voor biotechnologen.
Vroeger gaven ze cellen een "gemiddeld" adres: "Ga naar het centrum van de stad." Nu weten ze: "Ga niet naar het centrum, want daar is het te druk. Ga naar de rustige wijk, maar zorg dat je niet in de modderige straat belandt."

Door te kijken naar de geschiedenis van de reis van elke cel (waar was hij, hoe hard werd hij geslingerd), kunnen wetenschappers nu bioreactoren van elke grootte ontwerpen die precies hetzelfde gevoel geven aan de cellen.

Kortom:
Om miljarden cellen te maken voor harttransplantaties, moeten we stoppen met kijken naar gemiddelden en gaan kijken naar de individuele reis van elke cel. Als we de "waterkracht" die ze voelen precies goed afstemmen op hun grootte, kunnen we deze wondercellen veilig en snel laten groeien, of de machine nu klein of gigantisch is.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Voor klinische toepassingen, zoals het herstellen van hartweefsel na een infarct, zijn enorme hoeveelheden humane pluripotente stamcellen (hPSC's) vereist (ongeveer $1 \times 10^9$ cellen per dosis). Traditionele 2D-kweeksystemen zijn niet schaalbaar genoeg. 3D-suspensiekweek in bioreactoren biedt een oplossing, maar de opbrengst, levensvatbaarheid en kwaliteit van de cellen worden sterk beïnvloed door het hydrodynamische milieu (stroming en krachten).

Bij het opschalen van bioreactoren (bijv. van 100 mL naar 500 mL of groter) wordt traditioneel gebruikgemaakt van Euleriaanse benaderingen. Hierbij worden parameters zoals het volume-gegemiddelde energiedissipatiepercentage (EDR), maximale schuifspanning, of roersnelheid constant gehouden. De auteurs stellen echter dat deze methoden tekortschieten omdat ze geen rekening houden met:

1. De specifieke trajecten die celaggregaten doorlopen binnen de bioreactor.
2. De invloed van aggregaatgrootte en -dichtheid op de krachten die op de cellen werken (zoals zwaartekracht, drag en lift).
3. Het feit dat cellen niet overal in de reactor dezelfde blootstelling ervaren; ze kunnen tijdelijk in zones met hoge of lage krachten terechtkomen die niet worden weergegeven door een volume-gemiddelde.

Methodologie

De studie combineert in silico (computersimulaties) en in vitro (experimentele) benaderingen om de blootstelling van hPSC-aggregaten aan mechanische stimuli te karakteriseren in Vertical Wheel Bioreactors (VWBR's).

1. Computational Fluid Dynamics (CFD) Simulaties:

• Modellen: Transiente, 3D-turbulente stromingssimulaties uitgevoerd voor twee VWBR-groottes (100 mL en 500 mL) bij vijf roersnelheden (20-80 rpm).
• Fysica: Gebruik van het realizable $k-\epsilon$ turbulentiemodel voor de vloeistofstroming (mTeSR1 medium) met een vrij lucht-vloeistof oppervlak.
• Lagrange-benadering: Celmassa's werden gemodelleerd als bolvormige deeltjes (aggregaten) met diameters variërend van 200 tot 1000 µm. De beweging van deze deeltjes werd berekend door Newtons tweede wet te integreren, rekening houdend met krachten zoals drag, lift, zwaartekracht, drukgradiënt en virtuele massa.
• Data-extractie: Langs de berekende trajecten werden de geschiedenis van de blootstelling aan schuifspanning ($\tau$) en energiedissipatiepercentage (EDR) vastgelegd.

2. In vitro Experimenten:

• Celtype: ESI-017 hPSC's.
• Opzet: Kweek in 100 mL en 500 mL VWBR's bij 30, 40 en 60 rpm gedurende 6 dagen.
• Metrieken: Aggregatie-efficiëntie, dagelijkse fold-ratio's (groei), totale fold-ratio, en aggregaatgrootte werden gemeten.

Belangrijkste Bijdragen

• Verschuiving van Euleriaans naar Lagrange: Het artikel introduceert een nieuwe schaalvergrotingsstrategie die gebaseerd is op de geschiedenis van de trajectgebonden blootstelling van celaggregaten aan mechanische krachten, in plaats van statische volume-gemiddelden.
• Kwantificering van Trajectverschillen: Het toont aan dat de daadwerkelijke blootstelling van aggregaten sterk afhangt van hun grootte en de bioreactorgrootte, en dat deze waarden significant afwijken van de maximale of volume-gemiddelde waarden die vaak worden gebruikt voor schaalvergroting.
• Validatie van EDR vs. Schuifspanning: Het biedt experimenteel bewijs dat EDR een sterkere voorspeller is voor biologische uitkomsten (zoals aggregatie en totale groei) dan schuifspanning binnen de geteste condities.

Resultaten

1. Stromingsveld en Trajecten:

• De stroming in VWBR's vertoont twee circulatiezones: een primaire zone rond het roerwiel en een secundaire zone in het bovenste domein.
• Aggregaatgrootte: Grotere aggregaten (door zwaartekracht) zakken sneller en blijven langer in de zones met hoge EDR en schuifspanning rond het roerwiel. Kleinere aggregaten blijven langer in het bovenste domein met lagere krachten.
• Bioreactorgrootte: Bij dezelfde roersnelheid ervaren aggregaten in de 500 mL reactor hogere snelheden en krachten dan in de 100 mL reactor, vanwege de grotere tangentiële snelheid aan de rand van het grotere wiel.

2. Blootstelling aan EDR en Schuifspanning:

• Afwijking van Gemiddelden: Geen enkel getraceerd aggregaat bereikte de maximale waarden van het vloeistofveld. De daadwerkelijke blootstellingsverdelingen waren rechtsscheef (veel tijd in lagere waarden, maar met lange staarten naar hogere waarden).
• Schaalvergrotingsvalkuil: Een schaalvergroting gebaseerd op gelijke volume-gemiddelde schuifspanning (bijv. 100 mL bij 40 rpm vs. 500 mL bij 30 rpm) resulteerde in zeer verschillende trajecten en blootstellingsgeschiedenissen voor de cellen.

3. Biologische Uitkomsten:

• Aggregatie-efficiëntie: Het hoogst bij 30 rpm (EDR < $2.0 \times 10^{-4} m^2/s^3$).
• Totale celgroei (Fold Ratio): Het hoogst bij 40 rpm, ondanks dat 60 rpm een hogere dagelijkse groeisnelheid had. Dit suggereert dat een variabele snelheidsprotocollen nodig zijn: lagere snelheid voor initiële aggregatie, gevolgd door hogere snelheid voor proliferatie.
• EDR vs. Schuifspanning: EDR had een significant effect op aggregatie-efficiëntie, aggregaatgrootte en totale fold-ratio. Schuifspanning had een minder groot effect op deze specifieke uitkomsten binnen de geteste bereiken.
• Concordantie-analyse: Volume-gemiddelde EDR-waarden varieerden sterk tussen condities zonder een consistente relatie te tonen met biologische uitkomsten, terwijl de Lagrange-blootstellingsverdelingen beter correleerden met de waargenomen verschillen in aggregatie en groei.

Significantie en Conclusie

De studie concludeert dat traditionele schaalvergrotingsmethoden (gebaseerd op volume-gemiddelden of maximale waarden) ontoereikend zijn voor Vertical Wheel Bioreactors. De mechanische omgeving die cellen ervaren, wordt bepaald door hun beweging door het vloeistofveld, wat sterk beïnvloed wordt door de aggregaatgrootte en de bioreactorgeometrie.

Kernboodschap: Voor een succesvolle schaalvergroting moet men kijken naar de Lagrange-blootstellingsgeschiedenis (de verdeling van EDR en schuifspanning die een cel daadwerkelijk ondervindt tijdens zijn reis door de reactor). Dit biedt een robuustere basis om bioreactorcondities te optimaliseren voor maximale opbrengst en kwaliteit van hPSC's, en suggereert dat dynamische protocollen (waarbij de roersnelheid tijdens de kweek wordt aangepast) noodzakelijk kunnen zijn om de optimale balans tussen aggregatie en proliferatie te behouden.