A structured-illumination miniscope for optically sectioned imaging and real-time neural decoding

Stel je voor dat je probeert te luisteren naar een enkele violist die een prachtige solo speelt midden in een drukke, lawaaierige concertzaal. Dat is de dagelijkse strijd van wetenschappers die individuele hersencellen met elkaar willen zien "praten" terwijl een dier rent, springt of op ontdekkingstocht gaat. Jarenlang hebben ze kleine, lichtgewicht microscopen gebruikt die op de koppen van muizen zijn bevestigd om dit te doen. Deze apparaten zijn als kleine camera's die de gloeiende signalen van vurende neuronen kunnen zien. Echter, er is een groot probleem: deze camera's zien alles wat voor hen ligt, niet alleen de specifieke laag waar ze naar kijken. Het is alsoals proberen een heldere foto te maken van een specifieke rij stoelen in een stadion, maar de camera legt ook de wazige, gloeiende menigte in de rijen erboven en eronder vast. Deze "uit-focus" gloed wast de details weg, waardoor het moeilijk is om precies te zien welk neuron wat doet. Hoewel krachtige, dure microscopen bestaan die dit kunnen oplossen door speciale lasers te gebruiken om de wazige lagen te negeren, zijn deze te zwaar en complex om op een rennende muis te bevestigen. Zo zaten wetenschappers tussen twee vuren: ofwel een helder beeld van een klein gebied met een zware machine, ofwel een lichtgewicht camera die een wazige bende ziet.

Dit artikel introduceert een slimme, lichtgewicht oplossing die fungeert als een "slim filter" voor deze kleine camera's. De onderzoekers hebben een nieuw soort miniscope gebouwd dat minder dan 3 gram weegt (ongeveer evenveel als een AA-batterij) en gebruikmaakt van een truc genaamd "gestructureerde illuminatie". Denk aan het schijnen van een zaklamp door een hekwerk op een muur. Als je normaal licht door een hek schijnt, zie je de hele muur. Maar als je licht door het hek schijnt, zie je strepen. De slimme camera in dit nieuwe apparaat maakt twee snelle opnames: één met normaal licht en één met het "gestreepte" licht. Door deze twee foto's met elkaar te vergelijken, kan de computer wiskundig bepalen welke delen van het beeld scherp en in focus zijn (de strepen zijn duidelijk) en welke delen wazige achtergrondruis zijn (de strepen worden wazig). Het kan vervolgens de wazige delen aftrekken, waardoor een kristalhelder beeld overblijft van alleen de neuronen waar het naar kijkt. Dit stelt de muis in staat om vrij te rennen terwijl wetenschappers hoogwaardige, heldere gegevens krijgen zonder zware, dure apparatuur nodig te hebben.

Het "Slimme Filter" voor Breincamera's

Het team, onder leiding van onderzoekers van het Chinese Instituut voor Breinforschung en de Beijing Normal University, heeft dit nieuwe apparaat ontwikkeld om het "wazige achtergrond"-probleem op te lossen. Ze noemen het een HiLo miniscope. De naam komt van de techniek die het gebruikt: High-frequency en Low-frequency lichtverwerking.

Zo werkt het in begrijpelijke taal:
Het apparaat gebruikt twee kleine blauwe LED's (lichtbronnen). De ene schijnt een normaal, gelijkmatig licht op de hersenen. De andere schijnt licht door een eenvoudig rooster (een zogenaamde Ronchi-grating), wat een patroon van strepen op de hersenen creëert. De camera maakt een foto van het gelijkmatige licht, en daarna een foto van het gestreepte licht, en doet dit razendsnel — 30 keer per seconde.

Omdat de neuronen waarop de camera gefocust is scherp zijn, zien de strepen er op hen scherp uit. Maar de wazige, buiten-focus cellen in de achtergrond vertonen de strepen niet duidelijk; ze zien er slechts uit als een vage gloed. De computer kijkt naar de twee foto's en zegt: "Oké, de delen die eruitzien als strepen zijn het echte signaal. De delen die eruitzien als een vage gloed zijn slechts achtergrondruis." Het gooit vervolgens de vage gloed weg en houdt het scherpe signaal over. Het resultaat is een video van de hersenen die veel duidelijker is en een veel beter contrast heeft dan standaardcamera's.

Wat ze vonden: Heldere signalen, meer neuronen

De onderzoekers hebben dit nieuwe microscoop op verschillende manieren getest om te zien of het echt werkte.

1. Het ruimt de ruis op:
Eerst bekeken ze hersensneden van een muis. De beelden van de nieuwe HiLo-microscoop vertoonden een enorme afname van de "vage gloed" vergeleken met standaard widefield-beelden. De neuronen sprongen duidelijk naar voren tegen een donkere achtergrond.

2. Het werkt bij rennende muizen:
Vervolgens bevestigden ze het apparaat op de koppen van muizen en keken hoe ze rondrenden. Ze registreerden de activiteit in de hippocampus, een deel van de hersenen dat betrokken is bij geheugen en navigatie.

• Het resultaat: De signalen van individuele neuronen waren veel schoner. Wanneer ze naar de gegevens keken, was de "signaal-ruisverhouding" (hoeveel echte hersenactiviteit er is vergeleken met de achtergrondruis) met de HiLo-microscoop aanzienlijk beter dan met de standaardmodellen.
• Het coole deel: Normaal gesproken moeten wetenschappers, om heldere gegevens van een standaardmicroscoop te krijgen, complexe computerprogramma's gebruiken om de signalen na het experiment te "demixen". Dit kost veel tijd en rekenkracht. De onderzoekers ontdekten dat ze met de HiLo-microscoop simpelweg een gemiddelde konden nemen van de pixels in het gebied van een neuron, en dat dit bijna net zo goed was als de complexe, door de computer gecorrigeerde gegevens van de standaardmicroscoop. Dit betekent dat ze direct hoogwaardige gegevens kunnen krijgen, zonder te hoeven wachten op een trage computer die het later moet corrigeren.

3. Het ziet meer lagen:
De microscoop heeft ook een speciale vloeibare lens waarmee het heel snel kan focussen. Het team gebruep deze om tegelijkertijd naar twee verschillende dieptes in de hersenen te kijken, door tweeënhalf keer per seconde heen en weer te schakelen.

• Het resultaat: Dit stelde hen in staat om veel meer neuronen te registreren dan voorheen. Ze ontdekten dat het kijken naar twee lagen hen een veel grotere groep neuronen opleverde om te bestuderen, en dat de signalen van beide lagen nog steeds helder en betrouwbaar waren.

4. Het helpt bij het decoderen waar de muis zich bevindt:
Omdat de signalen zo helder waren, konden de onderzoekers de locatie van de muis in de kamer bepalen door enkel naar de hersenactiviteit te kijken.

• Het resultaat: Wanneer ze de eenvoudige HiLo-signalen gebruikten om de locatie van de muis te voorspellen, waren ze veel nauwkeuriger dan wanneer ze standaard widefield-signalen gebruikten. Sterker nog, de eenvoudige HiLo-signalen waren bijna net zo goed als de complexe, door de computer gecorrigeerde signalen van de standaardmicroscoop. Dit bewijst dat de "slimme filter" de belangrijke informatie vastlegt op het moment van de opname zelf.

De "Mind-Control" Test: Een Closed-Loop Brain-Machine Interface

Het meest opwindende deel van de studie was een "proof-of-principle" test om te zien of deze technologie gebruikt kon worden voor een brain-machine interface (BMI). Dit is een systeem waarbij de hersenen in real-time een machine aansturen.

De Opstelling:
Ze plaatsten een muis in een vaste positie en gaven hem een geur (een geur). Wanneer de hersenactiviteit van de muis overeenkwam met een specifiek patroon (zoals een "ik ruik dit"-signaal), gaf de computer de muis onmiddellijk een druppel zoet water als beloning.

De Uitdaging:
Om dit te laten werken, moet de computer het hersensignaal lezen, beslissen of het aan het patroon voldoet, en de beloning onmiddellijk leveren. Als het signaal wazig is of als de computer te lang nodig heeft om het te corrigeren, faalt het systeem.

Het Resultaat:
Met behulp van de HiLo-microscoop werkte het systeem perfect. Omdat de microscoop direct zulke heldere signalen leverde, kon de computer het "geurpatroon" in real-time detecteren en de beloning activeren. De muizen leerden het systeem te besturen; ze konden hun hersenactiviteit aanpassen om meer beloningen te krijgen. Dit toonde aan dat de HiLo-microscoop snel en helder genoeg is om te worden gebruikt voor experimenten waarbij real-time feedback nodig is, waarbij de hersenen met een machine communiceren en direct feedback krijgen.

Waarom dit ertoe doet

Dit artikel beweert niet dat het een toverstaf heeft uitgevonden die elk probleem in de neurowetenschap oplost. De auteurs merken er zorgvuldig bij op dat hun apparaat niet zo diep in de hersenen kan kijken als de zware, dure multiphoton-microscopen, en dat het overlappende neuronen niet zo perfect scheidt als de meest geavanceerde computeralgoritmen.

Echter, zij hebben aangetoond dat gestructureerde illuminatie een praktische, toegankelijke en zeer effectieve manier is om de kwaliteit van hersenbeeldvorming bij vrij bewegende dieren te verbeteren. Door het beeld te zuiveren voordat de computer het zelfs maar ziet, hebben ze het mogelijk gemaakt om hoogwaardige gegevens te verkrijgen zonder zware apparatuur of trage, complexe verwerking nodig te hebben. Dit opent de deur naar meer experimenten die snelle, real-time feedback vereisen, wat helpt om te begrijen hoe de hersenen werken terwijl een dier daadwerkelijk iets doet, in plaats van alleen maar stil te zitten.

Kortom, ze hebben een kleine, slimme camera gebouwd die de ruis wegfiltert, waardoor wetenschappers de "violist" duidelijk kunnen horen, zelfs midden in de "concertzaal".