PRISM: A Plasmid-based Reporter for Intracellular Spectral Microscopy

In elke levende cel werkt een bruisende stad van kleine, door membranen omgeven compartimenten samen om het leven gaande te houden. Deze compartimenten, bekend als organellen, zijn geen statische eilanden die drijven in een zee van vloeistof; het zijn dynamische structuren die voortdurend van vorm veranderen, naar verschillende locaties bewegen en naar elkaar uitreiken om contact te maken. Net zoals de indeling van een stad onthult hoe haar inwoners leven en werken, vertelt de ordening en interactie van deze cellulaire onderdelen wetenschappers iets over de gezondheid van de cel en de reactie ervan op de wereld om haar heen. Wanneer een cel te maken krijgt met stress, zoals een virale infectie of een chemische verandering, herstructureert dit interne netwerk zichzelf. Het was echter moeilijk om dit complexe, verschuivende landschap te observeren. Traditionele microscopen hebben vaak moeite om meer dan één of twee soorten van deze compartimenten tegelijkertijd te zien zonder dat de kleuren in elkaar overvloeien, wat het lastig maakt om het volledige netwerk in kaart te brengen of te zien hoe een verandering in één deel het hele systeem beïnvloedt.

Om dit op te lossen, hebben onderzoekers een nieuwe tool ontwikkeld genaamd PRISM, wat staat voor een Plasmid-gebaseerde Reporter voor Intracellulaire Spectrale Microscopie. Denk aan PRISM als een meestersleutel die een helder, veelkleurig beeld van het binnenste van de cel ontsluit. De wetenschappers creëerden een enkel genetisch pakketje dat, wanneer het in een cel wordt ingebracht, de cel instrueert om vijf verschillende fluorescerende markers te bouwen. Elke marker geeft licht in een specifieke kleur en brengt een ander cruciaal organel in beeld: het Golgi-apparaat, dat eiwitten verpakt; peroxisomen, die gifstoffen afbreken; het endoplasmatisch reticulum, een uitgestrekt netwerk voor de productie van eiwitten en lipiden; mitochondriën, de energiecentrales van de cel; en lysosomen, de recyclingcentra. Omdat deze markers in het eigen DNA van de cel zijn gebouwd, blijven ze daar permanent aanwezig, waardoor onderzoekers dezelfde cellen keer op keer kunnen bestuderen. Cruciaal is dat de kleuren van deze markers enigszins overlappen, maar de onderzoekers gebruiken een speciaal type microscoop dat ze kan scheiden zoals een prisma licht splitst, waardoor elk organel duidelijk zichtbaar blijft, zelfs wanneer ze dicht op elkaar gepakt zitten.

Met deze tool in handen zette het team zich schrap om te zien hoe het interne netwerk van de cel reageert op verschillende uitdagingen. Eerst verstoorden ze het interne skelet van de cel, het raamwerk van eiwitvezels dat organellen helpt te bewegen en hun vorm te behouden. Ze gebruikten twee verschillende medicijnen: één die de vezels gemaakt van actine afbreekt, en een andere die de vezels gemaakt van microtubuli ontmantelt. Toen ze de actinevezels afbraken, veranderde de vorm van de cellen, maar de interne organellen bleven grotendeks op hun gebruikelijke posities. Echter, toen ze de microtubuli ontmantelden, waren de resultaten spectaculair. Het Golgi-apparaat, dat normaal gesproken een compacte stapel nabij het centrum is, viel uiteen in tientallen kleine fragmenten die door de cel verspreid raakten. Verrassend genoeg veranderden ook de lysosomen; in plaats van zich gelijkmatig te verspreiden, klonterden ze samen tot grotere, onregelmatige groepen. Dit bevestigde dat microtubuli de primaire snelwegen zijn voor het verplaatsen van deze specifieke compartimenten, en dat de cellulaire stad zonder hen haar organisatie verliest.

De kracht van PRISM ging verder dan alleen het observeren van individuele organellen; het stelde de wetenschappers in staat om te zien hoe deze compartimenten elkaar raken en met elkaar interageren. Ze telden de punten waar de verschillende markers overlapten, wat onthulde welke delen van de cel contact maakten. Na het verbreken van de microtubuli ontdekten ze dat de verbindingen tussen het endoplasmatisch reticulum en de mitochondriën aanzienlijk veranderden. De contacten werden minder in aantal, maar groter in omvang, wat suggereert dat het netwerk zijn interfaces herstructureert. Nog complexer was dat de onderzoekers "hogere-orde" contacten konden bekijken, waarbij drie of meer verschillende organellen op dezelfde plek samenkomen. Ze ontdekten dat specifieke groepen van drie, zoals het endoplasmatisch reticulum, peroxisomen en mitochondriën, gevoelig waren voor de verstoring, wat wijst op een gecoördineerde netwerkreactie die onzichtbaar zou zijn gebleven als ze alleen naar paren organellen hadden gekeken.

De onderzoekers pasten deze methode vervolgens toe op een ander soort stress: schade aan de lysosomen. Ze behandelden cellen met een chemische stof die deze recyclingcentra beschadigt en voegden een speciale sensor toe die oplicht wanneer deze een specifiek lipide molecuul vindt genaamd PI(4)P. In gezonde cellen is dit lipide voornamelijk te vinden op het Golgi-apparaat. Maar wanneer de lysosomen beschadigd waren, toonde de sensor aan dat het lipide weg bewoog van het Golgi-apparaat en zich ophoopte op de membranen rondom de beschadigde lysosomen. Deze verschuiving suggereerde dat de cel actief probeert de beschadigde delen te repareren of te verwijderen, een proces dat bekend staat als lysofagie. De tool stelde hen in staat om deze moleculaire verkeersopstopping en de fysieke veranderingen in de lysosomen tegelijkertijd te zien, waardoor een chemisch signaal direct aan een structurele respons werd gekoppeld.

Ten slotte gebruikten het team PRISM om te kijken wat er gebeurt wanneer een cel geïnfecteerd raakt door het Zika-virus. Virussen kapen vaak de machinerie van een cel om kopieën van zichzelf te maken, en dit vereist meestal een enorme herschikking van het interne landschap. De onderzoekers infecteerden cellen en maakten onderscheid tussen de geïnfecteerde en de niet-geïnfecteerde buren. Ze ontdekten dat het virus het endoplasmatisch reticulum deed condenseren tot dichte clusters, waarschijnlijk om fabrieken voor nieuwe viruspartikels te bouwen. De mitochondriën braken in kleinere stukjes en de peroxisomen verdwenen. Maar de meest opvallende bevinding was een wijdverspreide instorting van de verbindingen tussen organellen. Het virus veranderde niet alleen de vorm van individuele onderdelen; het verbrak de verbindingen tussen hen, waardoor het totale oppervlak waar organellen elkaar raken afnam. Dit omvatte ook de complexe drievoudige ontmoetingen tussen het endoplasmatisch reticulum, de mitochondriën en de lysosomen, die bekend staan om hun belang voor de celgezondheid.

Door een stabiele, reproduceerbare manier te bieden om vijf verschillende delen van de cel tegelijkertijd te zien, biedt PRISM een nieuw venster op het verborgen leven van de cel. Het laat zien dat wanneer een cel onder stress staat, of het nu door een medicijn of een virus komt, de reactie niet slechts een verandering in één onderdeel is, maar een gecoördineerde herstructurering van het gehele netwerk. De tool onthult dat de compartimenten van de cel diep met elkaar verbonden zijn, en dat het verbreken van de verbindingen tussen hen even betekenisvol kan zijn als het veranderen van hun vorm. Deze benadering stelt wetenschappers in staat om van het kijken naar geïsoleerde puzzelstukjes over te gaan naar het begrijpen van het volledige plaatje van hoe cellen zich aanpassen, overleven en soms falen in het aangezicht van uitdagingen.