High-Dimensional Multi-omic Mapping of Post-Mortem Human Brain Using Iterative Indirect Immunofluorescence Imaging on Xenium-Processed Tissues

Het menselijk brein is een landschap van enorme complexiteit, waar miljarden cellen samenwerken om gedachte, geheugen en beweging te creëren. Decennialang hebben wetenschappers geprobeerd dit landschap te begrijpen door individuele cellen te bestuderen, maar een grote beperking is geweest het verlies van locatie. Wanneer onderzoekers cellen extraheren om hun genetische instructies te bestuderen, verscheuren ze in feite een kaart en verdelen deze in stukjes, waardoor de context van waar elk stukje thuishoorde verloren gaat. In de afgelopen jaren heeft een nieuwe generatie technologie genaamd ruimtelijke transcriptomica het wetenschappers mogelijk gemaakt om de genetische instructies van cellen te lezen terwijl ze op hun oorspronkelijke plaats in een weefselsnede verblijven. Dit is een doorbraak geweest, die heeft onthuld hoe verschillende celtypen zijn gerangschikt en hoe zij met elkaar interageren. Het lezen van de genetische code alleen is echter niet altijd voldoende. Genen zijn de blauwdrukken, maar de eiwitten die zij bouwen zijn de werkelijke arbeiders en structuren die de vorm en functie van een cel bepalen. In ziekten zoals Alzheimer, waarbij de architectuur van het brein wordt verstoord door klonten eiwit en verstrengelde vezels, is het kennen van de genetische code zonder de fysieke structuur te zien, als het proberen te begrijpen van een stad door de telefoonboeken te lezen zonder ooit de gebouwen te hebben gezien.

Om deze kloof te overbruggen, heeft een team onderzoekers van Columbia University en Rush University een methode ontwikkeld die twee krachtige technieken combineert op hetzelfde stuk hersenweefsel. Ze begonnen met een hoogtechnologisch beeldvormingssysteem genaamd Xenium, dat de genetische activiteit van duizenden genen in een enkele weefselsnede leest met ongelooflijke precisie. Normaal gesproken wordt het weefsel na voltooiing van dit proces als "opgebruikt" beschouwd voor verdere eietanalyse. De onderzoekers vonden echter een manier om het weefsel te bewaren voor een tweede ronde van onderzoek. Nadat de genetische lezing voltooid was, pasten ze een reeks zorgvuldig getimede chemische behandelingen toe om de genetische sondes te verwijderen met behulp van een gespecialiseerde buffer, en kleurden ze vervolgens hetzelfde weefsel met antilichamen die specifieke eiwitten laten oplichten. Door deze cyclus van kleuring, beeldvorming en verwijdering vijf keer te herhalen, creëerden ze een hoogresolutiekaart van eiwitten die perfect overlapt met de genetische gegevens die ze al hadden verzameld. Dit stelde hen in staat om niet alleen te zien welke genen actief waren, maar ook hoe de cellen eruit zagen en of ze gevangen zaten in de pathologische vallen van de ziekte van Alzheimer.

De onderzoekers testten deze aanpak op hersenweefsel uit de calcarine cortex, een regio aan de achterkant van het brein die betrokken is bij het zicht, afkomstig van deelnemers aan de Religious Orders Study (ROS) en de Rush Memory and Aging Project (MAP) die waren overleden. Ze richtten zich op gebieden die bekend staan om de kenmerken van Alzheimer, zoals amyloïde plaques en tau-eiwit-tangles, evenals afwijkingen in de bloedvaten. Het team ontwierp een panel van markers om de belangrijkste celtypen in het brein te identificeren, waaronder neuronen, astrocyten, microglia en oligodendrocyten, evenals specifieke tekenen van ziekte. Ze voerden eerst de genetische sequencing uit, en gebruikten vervolgens een gespecialiseerde chemische buffer om de genetische sondes te verwijderen zonder het weefsel of de onderliggende eiwitten te beschadigen. Daarna brachten ze een nieuwe set antilichamen aan om specifieke eiwitten te laten oplichten, maakten ze foto's met een hoge resolutie, en herhaalden ze dit proces van verwijderen en kleuren nog vier keer. Dit iteratieve proces, bekend als 4i, stelde hen in staat om in totaal vijftien verschillende eiwitmarkers op exact hetzelfde weefselstuk vast te leggen, wat een rijk, gelaagd beeld van het micro-milieu van het brein opleverde.

Een van de meest significante resultaten van dit werk was de mogelijkheid om celtypen met veel grotere nauwkeurigheid te identificeren dan voorheen. In standaard genetische studies moeten wetenschappers vaak raden welk type cel ze bekijken op basis van enkel welke genen aanstaan, wat luidruchtig en verwarrend kan zijn. Door de eiwitgegevens toe te voegen, konden de onderzoekers de fysieke vorm en de eiwitmarkers van de cellen gebruiken om hun identiteit te bevestigen. Ze trainden een computerprogramma om de vormen van verschillende celkernen te herkennen op basis van de eiwitbeelden. Dit programma leerde het onderscheid te maken tussen neuronen, die een specifieke vorm en eiwithandtekening hebben, en microglia, de immuuncellen van het brein, die er anders uitzien en andere markers dragen. Toen ze dit systeem testten, identificeerde het correct de belangrijkste celtypen in de overgrote meerderheid van de gevallen, wat een solide fundament bood voor de genetische gegevens. Dit betekende dat wanneer de onderzoekers naar de genetische activiteit van een specifieke cel keken, ze veel zekerder konden zijn over wat die cel daadwerkelijk was.

De studie onthulde ook hoe de fysieke grenzen van cellen de aflezing van genetische gegevens beïnvloeden. In het brein hebben cellen vaak lange, vertakte armen die uitreiken om contact te maken met hun buren. Wanneer wetenschappers proberen genetische berichten aan een cel toe te wijzen, moeten ze beslissen hoe ver ze de grens van de cel vanuit het centrum moeten trekken. Als de lijn te klein is, missen ze belangrijke berichten; als de lijn te groot is, kunnen ze per ongeluk berichten van een buurman tellen. Door de genetische gegevens te vergelijken met de duidelijke eiwitcontouren van de cellen, ontdekten de onderzoekers dat het uitbreiden van de celgrens met een kleine, vaste hoeveelheid van vijf micrometer het beste werkte. Deze eenvoudige aanpassing legde de genetische berichten accuraat vast zonder ze te mengen met die van naburige cellen, waarmee een veelvoorkomend probleem in de ruimtelijke biologie werd opgelost.

Misschien wel het belangrijkste was dat deze methode het team in staat stelde om te zien hoe verschillende cellen gepositioneerd zijn ten opzichte van de schade veroorzaakt door de ziekte van Alzheimer. Ze konden exact in kaart brengen waar de amyloïde plaques en tau-tangles zich bevonden en zien welke specifieke celtypen eromheen gegroepeerd waren. Ze observeerden dat bepaalde immuuncellen en ondersteunende cellen zich nabij deze pathologische kenmerken verzamelden, waardoor een specifiek micro-milieu van de ziekte ontstond. Omdat al deze informatie afkomstig was van hetzelfde weefselstuk, waren de verbanden tussen de genetische activiteit, de eiwitmarkers en de fysieke locatie van de ziekte direct en onbetwistbaar. De onderzoekers toonden aan dat deze workflow robuust is en kan worden toegepast op menselijk hersenweefsel dat is geconserveerd in formaline, wat de standaardmanier is waarop de meeste medische archieven hersenmonsters bewaren.

Dit werk beweert niet de ziekte van Alzheimer te hebben genezen of het mysterie van de ziekte te hebben opgelost. In plaats daarvan biedt het een nieuwe, preciezere tool om naar het brein te kijken. Door genetische lezing te combineren met eiwitbeeldvorming op hetzelfde weefsel, hebben de onderzoekers aangetoond dat het mogelijk is om een uitgebreide kaart van het cellulaire landschap van het brein te bouwen. Deze kaart bevat de genetische instructies, de fysieke structuren en de tekenen van ziekte, allemaal op één plek. De methode is flexibel en kan worden aangepast om naar verschillende eiwitten of verschillende ziekten te kijken, wat een manier biedt om de complexiteit van het brein te bestuderen met een detailniveau dat voorheen onmogelijk was. Voor wetenschappers die het verouderende brein bestuderen, biedt deze aanpak een helderder venster op hoe cellen veranderen en interageren in aanwezigheid van pathologie, wat potentieel kan leiden tot een dieper begrip van hoe deze ziekten zich ontwikkelen.