Covalent Solvatochromic Membrane Probe for Sensing Lipid Surrounding of Proteins

De grens tussen een cel en de rest van de wereld is geen eenvoudige muur, maar een bruisende, fluïde grens die bekend staat als het plasma-membraan. Deze dunne laag is een complex mozaïek van vetten, eiwitten en suikers dat controleert wat de cel binnenkomt en verlaat. Decennialang hebben wetenschappers dit membraan bestudeerd door lichtgevende kleurstoffen aan de vetcomponenten te bevestigen, vergelijkbaar met het plaatsen van een sticker op een rijdende auto om het pad te volgen. Deze stickers onthullen hoe de vetten zijn gerangschikt en hoe ze verschuiven, wat een kijk biedt op de "bulk"-eigenschappen van het membraan. Echter, deze aanpak mist een cruciaal detail: het membraan is niet alleen een zee van vet; het is een landschap bevolkt door eiwitten die het essentiële werk van de cel verrichten. Deze eiwitten zijn ingebed in de vetlaag, waardoor een uniek grensvlak ontstaat waar het eiwit de omringende lipiden ontmoet. Het begrijpen van de specifieke omgeving direct naast deze eiwitten is essentieel, omdat dit hun functie beïnvloedt, maar traditionele lichtgevende kleurstoffen kunnen niet aan eiwitten hechten zonder eraf gewassen te worden of de chemische behandelingen die nodig zijn om cellen in detail te bestuderen, niet te overleven.

Een team onderzoekers aan de Universiteit van Straatsburg heeft een nieuwe tool ontwikkeld om dit probleem op te lossen, waardoor wetenschappers voor het eerst de directe omgeving van membraaneiwitten kunnen zien. Ze creëerden een moleculaire sonde die fungeert als een covalente haak, die zichzelf permanent aan de eiwitten op het celoppervlak bevestigt in plaats van alleen tussen de vetten te zweven. Deze sonde is gebouwd rond een kleurstof genaamd Nile Red, die van kleur verandert op basis van hoe polair, of waterminnend, de omgeving is. Door deze kleurstof permanent aan de eiwitten te koppelen, konden de onderzoekers de specifieke condities aan het eiwit-lipide-grensvlak observeren, een regio die voorheen onzichtbaar was voor standaard beeldvormingstechnieken. Hun werk onthult dat de omgeving direct naast de eiwitten chemisch verschillend is van de rest van het membraan en anders reageert op veranderingen in de samenstelling van de cel, wat een fris perspectief biedt op hoe cellen hun structuur en functie behouden.

De onderzoekers begonnen met het ontwerpen van een molecuul dat twee taken tegelijkertijd kon uitvoeren: de celmembraan vinden en zich daar aan de eiwitten vastklampen. Ze gebruikten een steiger die een anker met een lage affiniteit bevatte om het molecuul tijdelijk nabij het membraan te houden en een reactieve chemische groep die in staat is tot het vormen van een permanente binding met eiwitten. Aanvankelijk probeerden ze een versie met een enkel anker, maar deze bleef niet lang genoeg op het oppervlak om zijn werk te doen, omdat hij te snel de cel in gleed. Ze realiseerden zich dat de Nile Red-kleurstof hydrofober, of waterafstotender, was dan de kleurstoffen die in eerdere versies van deze tool werden gebruikt. Om dit op te lossen, synthetiseerden ze een nieuwe versie met twee ankers, waardoor de grip van het molecuul op het membraan effectief werd verdubbeld. Deze dubbel verankerde sonde, die zij MemGraft-NR noemden, hechtte zich binnen vijf minuten succesvol aan het celoppervlak en bleef daar, zelfs wanneer de cellen werden gewassen met serumrijke vloeistoffen die niet-covalente kleurstoffen zouden hebben weggespoeld.

Zodra de sonde stevig op zijn plaats zat, testte het team het vermogen om de lokale omgeving waar te nemen. Ze vergeleken MemGraft-NR, dat op eiwitten zit, met een standaard kleurstof genaamd NR12A, die vrij zweeft in de lipidelaag. Met een microscoop die het licht van de kleurstof in twee kleuren kon splitsen, maten ze de ratio van rood naar groen licht om de polariteit van de omgeving te bepalen. Ze vonden dat de omgeving direct naast de membraaneiwitten aanzienlijk polairder was dan de omringende lipidelaag. Dit bevestigde dat de sonde inderdaad een unieke micro-omgeving waarneemt die wordt gecreëerd door de aanwezigheid van het eiwit, die verschilt van het algemene membraan.

De onderzoekers daagden de cellen vervolgens uit met veranderingen in hun lipidensamenstelling om te zien hoe de sonde reageerde. Ze verwijderden cholesterol, een cruciaal structureel vet, en voegden het daarna in overvloed weer toe. Terwijl de standaard lipiden-gebonden kleurstof weinig reactie vertoonde op de toevoegging van extra cholesterol, reageerde de aan eiwitten gebonden sonde sterk, met een scherpe afname van de polariteit. Dit suggereert dat het gebied direct naast de membraaneiwitten niet op dezelfde manier verzadigd is met cholesterol als de rest van het membraan, en dat het toevoegen van meer cholesterol een diepgaand effect heeft op de directe omgeving van het eiwit. De sonde stelde het team ook in staat om het proces van permeabilisatie te observeren, waarbij detergentia worden gebruikt om gaatjes in het celmembraan te maken. Terwijl de lipiden werden weggewassen, detecteerde de sonde een geleidelijke toename van de polariteit over een periode van tien minuten, een dynamisch proces dat niet geobserveerd kon worden met traditionele kleurstoffen die simpelweg met de lipiden zouden wegspoelen.

Ten slotte observeerde het team wat er gebeurde toen de cellen de sonde internaliseerden via endocytose, een proces waarbij het celmembraan naar binnen vouwt om een belletje genaamd een endosoom te vormen. De sonde kwam de cel sneller binnen dan de standaard lipidekleurstof, waarschijnlijk omdat deze verbonden is aan eiwitten die van nature worden gerecycled in de cel. Binnen de nieuw gevormde endosomen detecteerde de sonde een dramatische daling in polariteit, wat wijst op een veel meer geordende en minder polaire omgeving dan aan het celoppervlak. Dit was een verrassende bevinding, aangezien de endosomen net zijn gevormd uit hetzelfde membraanmateriaal. De onderzoekers suggereren dat de hoge negatieve kromming van het binnenoppervlak van het endosoom de membraaneiwitten dieper in de lipidelaag kan duwen, waardoor hun directe omgeving verandert op een manier die de standaard lipidekleurstof niet kon detecteren.

Deze nieuwe tool voegt niet alleen een andere methode toe aan de lijst met cellulaire beeldvormingstechnieken; het verschuift de focus van de algemene eigenschappen van het membraan naar de specifieke condities op het grensvlak waar eiwitten en lipiden elkaar ontmoeten. Door een stabiele, covalente verbinding met membraaneiwitten te bieden, onthult de sonde dat de lipide-omgeving rond deze eiwitten zeer gevoelig is voor veranderingen in cholesterol en lipide-orde, en dat deze een significante reorganisatie ondergaat tijdens cellulaire processen zoals endocytose. Het werk suggereert dat het eiwit-lipide-grensvlak een afzonderlijke en dynamische regio van het celmembraan is, die een cruciale rol speelt in hoe cellen met hun omgeving interageren en hoe ze hun interne organisatie behouden.