A MBene-based electrochemical aptasensor for label-free detection of EpCAM-overexpressing cancer cells

Technische Samenvatting: MBene-gebaseerde elektrochemische aptasensor voor labelvrije detectie van EpCAM-overexpressieve kankercellen

Probleemstelling
Nauwkeurige detectie van tumorcellen is cruciaal voor kankerdiagnostiek en vroege interventie. Epitheliale celadhesiemolecuul (EpCAM) is een transmembraanglykoproteïne dat uitgebreid tot expressie komt in epitheliale afgeleide maligniteiten en dient als een belangrijke biomarker. Conventionele detectiemethoden zoals immunohistochemie, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en flowcytometrie zijn echter afhankelijk van labeling, vereisen arbeidsintensieve meerstapsverwerking en hebben gespecialiseerde apparatuur nodig. Deze beperkingen beperken hun bruikbaarheid in point-of-care (POC) settings. Hoewel elektrochemische biosensoren voordelen bieden op het gebied van gevoeligheid, snelheid en draagbaarheid, zijn veel bestaande systemen afhankelijk van complexe oppervlaktemodificaties of ingewikkelde signaalversterkingsmechanismen die de praktische bruikbaarheid en reproduceerbaarheid in gevaar brengen. Er is behoefte aan een labelvrije, toegankelijke strategie die operationele eenvoud combineert met een hoge analytische prestatie voor de detectie van EpCAM-overexpressieve kankercellen.

Methodologie
De studie presenteert een labelvrije elektrochemische aptasensor, geconstrueerd op screen-printed gouden elektroden (SPGEs) met behulp van twee-dimensionale MBene-nanosheets als een functioneel interface.

• Materiaalsynthese: Twee-dimensionale CrB MBene-nanosheets werden gesynthetiseerd via de selectieve etsing van een Cr₂AlB₂-precursor met behulp van 2 M HCl. Dit proces verwijderde de tussenliggende aluminiumlagen, wat resulteerde in een poreuze, gelaagde morfologie met een hoge oppervlakte-ruwheid en zuurstofhoudende oppervlakterminaties (–OH, B–O).
• Sensorfabricage: De sensorinterface werd stapsgewijs samengesteld op SPGEs:
  1. MBene-modificatie: MBene-nanosheets werden op de gouden werkelektrode gedropt (drop-cast) om een geleidend, biocompatibel interface te creëren.
  2. Aptameer-immobilisatie: Thiolated EpCAM-specifieke aptameren werden op het MBene-oppervlak geïmmobiliseerd via Au–S bindingen.
  3. Blocking: Niet-specifieke bindingsplaatsen werden geblokkeerd met 6-mercapto-1-hexanol (MCH).
• Detectieprincipe: De sensor werkt via Elektrochemische Impedantiespectroscopie (EIS). De binding van EpCAM-eiwitten of EpCAM-overexpressieve cellen aan de aptameren creëert een isolerende laag die de elektronentransfer belemmert, wat resulteert in een toename van de ladingsoverdrachtweerstand ($R_{ct}$). Deze verandering ($\Delta R_{ct}$) dient als het kwantitatieve signaal.
• Validatiemodellen: Het systeem werd gevalideerd met behulp van:
  • Cellijnen: Ishikawa-cellen (EpCAM-overexpressief) en HEK293T-cellen (EpCAM-negatieve controle).
  • Klinische monsters: 44 echte klinische endometriale cytologische monsters (22 maligne, 22 benigne) verzameld via Li-Brush.
• Data-analyse: De diagnostische prestaties op klinische monsters werden geëvalueerd met behulp van machine learning-modellen (k-nearest neighbors, decision tree, SVM, logistische regressie), waarbij logistische regressie werd geïdentificeerd als de optimale classifier.

Kernbijdragen

• Nieuwe Materiaaltoepassing: Dit werk introduceert MBene, een boride-gebaseerde analoog van MXene, als een sensorische matrix voor elektrochemische aptasensing. De studie toont aan dat de hoge geleidbaarheid, het grote actieve oppervlak en de talrijke oppervlaktesites van MBene efficiënte elektronentransfer en stabiele aptameer-immobilisatie faciliteren.
• Labelvrije Architectuur: Het platform bereikt gevoelige detectie zonder de noodzaak van enzymatische labels of complexe signaalversterking, door te vertround op de intrinsieke impedantie-veranderingen veroorzaakt door doelwitbinding.
• Klinische Translatie: Voorbij gespiked laboratoriummonsters, valideert de studie de sensor met echte patiënt-afgeleide endometriale cytologische monsters, wat translationeel bewijs levert voor de toepasbaarheid in complexe biologische matrices.

Resultaten

• Karakterisering: SEM, XRD, XPS en FTIR bevestigden de succesvolle transformatie van Cr₂AlB₂ naar 2D CrB MBene met een poreuze structuur en oppervlaktehydroxylgroepen.
• Analytische Prestaties:
  • Eiwetdetectie: De sensor vertoonde een lineaire respons op EpCAM-eiwit van 10 fg mL⁻¹ tot 100 pg mL⁻¹, met een detectielimiet (LOD) van 8,86 fg mL⁻¹.
  • Celdetectie: Een lineaire respons werd waargenomen voor EpCAM-overexpressieve Ishikawa-cellen van 10¹ tot 10⁵ cellen mL⁻¹, met een LOD van 7 cellen mL⁻¹.
• Specificiteit en Stabiliteit: De sensor vertoonde een hoge specificiteit en onderscheidde Ishikawa-cellen van HEK293T-cellen met minimale interferentie van niet-doelcellen. Het demonstreerde uitstekende reproduceerbaarheid (RSD < 5%) en opslagstabiliteit, waarbij ~92% van het initiële signaal behouden bleef na 14 dagen bij 4°C.
• Klinische Prestaties: Bij de analyse van 44 endometriale cytologische monsters kon de sensor effectief onderscheid maken tussen maligne en benigne gevallen. Het logistische regressiemodel behaalde een sensitiviteit van 86,36%, een specificiteit van 86,36% en een Area Under the Curve (AUC) van 0,897. Deze prestatie was vergelijkbaar met of in balans met conventionele modaliteiten zoals transvaginale echografie en serum-biomarkers, terwijl het de invasiviteit van een weefselbiopsie vermeed.

Betekenis
Het artikel stelt dat dit werk een haalbare elektrochemische detectie-aanpak vestigt voor de labelvrije detectie van EpCAM-overexpressieve kankercellen. Door gebruik te maken van de geleidende en functionele eigenschappen van MBene-nanosheets, biedt het platform een strategie die sensitief, specifiek en reproduceerbaar is. De succesvolle validatie met klinische cytologische monsters suggereert een potentiële toepasbaarheid in klinische analyse en point-of-care diagnostiek. De auteurs positioneren dit werk als een complementaire strategie voor bestaande diagnostische instrumenten, waarbij de uitgebreide toepassing van MBene-nanomaterialen wordt benadrukt. De studie erkent beperkingen, zoals de relatief kleine cohortgrootte, en roept op tot toekomstige multi-center validatie om de klinische sensitiviteit en robuustheid verder te optimaliseren.