The Aorta-Gonad-Mesonephros niche shapes the functions of yolk sac-derived macrophages involved in hematopoietic stem and progenitor cell generation ex vivo

Resumo Técnico: O nicho da aorta-gônada-mesonefros molda as funções dos macrófagos derivados do saco vitelino envolvidos na geração de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas ex vivo

Problema
O transplante de células estaminais hematopoiéticas (HSC) é uma terapia curativa para distúrbios sanguíneos, mas sua aplicação é limitada pela escassez de doadores e pela doença enxerto contra o hospedeiro. A geração de HSCs específicas de pacientes a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) oferece uma solução, mas os protocolos de diferenciação atuais não conseguem recapitular totalmente a maturação das HSCs in vivo. Durante o desenvolvimento do camundongo, as HSCs emergem na região da aorta-gônada-mesonefros (AGM) via transição endotélio-hematopoiética (EHT). Embora os macrófagos derivados do saco vitelino (YS) sejam conhecidos por povoar a AGM no momento da emergência das HSCs, os mecanismos específicos pelos quais eles apoiam a geração de HSPCs ex vivo permanecem mal definidos. Além disso, não está claro se as funções dos macrófagos são intrínsecas à sua origem no YS ou moldadas pelo nicho da AGM.

Metodologia
O estudo empregou uma combinação de modelos de camundongos in vivo e ensaios funcionais in vitro:

• Modelos de Camundongos: Camundongos selvagens C57BL/6, MacGreen (Csf1r-EGFP), F4/80 knockout (KO) e de rastreamento de linhagem (Cdh5-CreERT2; Rosa26LSL-tdTomato) foram utilizados. Os embriões foram estagiados em E10.5.
• Separação Celular e Caracterização: Tecidos da AGM e do YS foram dissecados e digeridos. A citometria de fluxo foi usada para distinguir populações mieloides com base em CD45, CD11b, F4/80, cKit e CD206. Uma estratégia de gating refinada foi desenvolvida para separar macrófagos maduros CD206⁺ de progenitores mieloides CD206⁻.
• Ensaios Funcionais:
  • Ensaios de Unidade Formadora de Colônias (CFU-C) avaliaram o potencial de progenitor de células sorteadas em células estromais OP9.
  • Sistemas de Co-cultura testaram a capacidade dos macrófagos CD206⁺ de aumentar o potencial de progenitor de células endoteliais (ECs) provenientes tanto da AGM quanto do YS, incluindo co-culturas recíprocas (macrófagos da AGM com ECs do YS e vice-versa).
  • Rastreamento de Linhagem: Experimentos de pulse-chase com 4-OHT em E7.5 e E8.5 rastrearam a origem dos macrófagos da AGM.
• Transcriptômica: O sequenciamento de RNA em massa (RNA-seq) foi realizado em macrófagos CD206⁺ e CD206⁻ sorteados da AGM e do YS. A análise de expressão diferencial de genes (DESEx2) e a análise de interação ligante-receptor NicheNet foram usadas para identificar genes específicos do nicho e interações preditas com células endoteliais e de cluster.
• Validação: RT-qPCR e imunomarcação validaram os achados de RNA-seq e os níveis de expressão proteica (ex.: F4/80, Ccr2, Tnfr).

Principais Contribuições e Resultados

1. Definição da Maturidade de Macrófagos na AGM:
   O estudo estabelece que a expressão de CD206 define macrófagos terminalmente diferenciados no camundongo AGM em E10.5. Macrófagos CD206⁺ carecem de potencial de progenitor in vitro, enquanto células mieloides CD206⁻ (mesmo aquelas expressando F4/80) retêm capacidade de progenitor multipotente e podem gerar colônias hematopoiéticas.

2. Aquisição de Função Específica do Nicho:
   O rastreamento de linhagem confirmou que tanto os macrófagos CD206⁺ quanto os CD206⁻ da AGM originam-se de precursores endoteliais precoces derivados do YS, sem evidência de geração de macrófagos de novo dentro da AGM. Apesar desta origem compartilhada, os macrófagos da AGM adquirem propriedades específicas do nicho:

   • Mudança Transcriptômica: Macrófagos CD206⁺ da AGM regulam positivamente citocinas pró-inflamatórias (ex.: Tnf, Il18) e moléculas de adesão (Adgre1/F4/80) em comparação com seus homólogos do YS.
   • Divergência Funcional: Macrófagos CD206⁺ da AGM aumentam o potencial de progenitor de células endoteliais da AGM em co-cultura, enquanto macrófagos CD206⁺ do YS não aumentam o potencial de ECs do YS. Co-culturas recíprocas demonstraram que os macrófagos da AGM não podem conferir este benefício ao endotélio do YS, indicando que a função depende da interação cruzada com o microambiente da AGM, em vez de ser uma propriedade intrínseca determinada pela ontogenia.

3. Identificação de Genes Restritos à AGM:
   A análise de RNA-seq identificou um pequeno conjunto de genes preferencialmente regulados positivamente em macrófagos CD206⁺ da AGM em comparação com todas as outras populações: Mmp2, Nrep, Ccl2 e Cxcl16 (validados por RT-qPCR). A análise NicheNet previu que estes macrófagos interagem com células endoteliais (ECs) e células de cluster (CCs) através de ligantes como Ccl2 (ligando-se a Ccr2) e Tnfα (ligando-se a Tnfr), sendo que a expressão de receptores é mais elevada nas CCs.

4. Um Novo Papel Regulatório para F4/80:
   Utilizando embriões F4/80 KO, o estudo identificou um papel específico do nicho, anteriormente não relatado, para o F4/80 na AGM:

   • Efeitos na AGM: Na ausência de F4/80, a frequência de células endoteliais diminuiu, enquanto a frequência de células progenitoras cKit⁺ e a atividade formadora de colônias aumentaram. Isso sugere que o F4/80 normalmente restringe a frequência de HSPC enquanto apoia a manutenção endotelial na AGM.
   • Especificidade do YS: Estes efeitos estiveram ausentes no YS de embriões F4/80 KO, onde as frequências endoteliais e de progenitores permaneceram inalteradas em comparação com os controles.

Significância e Alegações
O artigo alega que os macrófagos da AGM, apesar de compartilharem uma origem no YS com outras células mieloides, passam por uma reprogramação transcricional e funcional ao entrarem no nicho da AGM. Esta reprogramação equipa-os com fatores específicos (ex.: Mmp2, Ccl2, Cxcl16) e um papel regulatório para o F4/80 que são críticos para moldar o output de HSPC na AGM.

Os autores postulam que estas descobertas fornecem uma base mecanística para refinar os protocolos de diferenciação de HSC baseados em iPSCs. Especificamente, sugerem que a adição direcionada e controlada no tempo de sinais derivados de macrófagos (como Ccl2, Tnfα e Cxcl16) e a modulação das interações de nicho poderiam melhorar a geração de HSCs funcionais in vitro. O estudo nota modestamente que, embora estes insights derivem de modelos de camundongos, a validação em modelos celulares humanos é essencial para determinar a relevância translacional, e que o papel in vivo de F4/80 na geração de HSC requer investigação adicional via ensaios de transplante.