Fecal iron quantification in a randomized controlled trial of Lactiplantibacillus plantarum ATCC 202195 in newborns in Dhaka, Bangladesh

Resumo Técnico: Quantificação de Ferro Fecal em um Ensaio Clínico Randomizado de Lactiplantibacillus plantarum ATCC 202195 em Recém-Nascidos

Definição do Problema
A deficiência de ferro (DF) é um problema crítico de saúde pública na primeira infância, particularmente em países de baixa e média renda (LMICs), com potenciais efeitos irreversíveis no neurodesenvolvimento. Embora a suplementação de ferro oral seja eficaz, ela acarreta riscos em ambientes com alta carga de infecção, podendo promover o crescimento bacteriano patogênico e causar eventos adversos, como diarreia sanguinolenta. Probióticos, especificamente os Lactobacilli, são hipotetizados para melhorar a absorção de ferro por meio de mecanismos como a alteração da microbiota intestinal, redução do pH intestinal e produção de metabólitos que aumentam a solubilidade do ferro. No entanto, as evidências sobre o efeito dos probióticos na absorção de ferro na primeira infância, particularmente sem a coadministração de ferro exógeno, permanecem escassas. Além disso, os métodos existentes para avaliar a biodisponibilidade do ferro frequentemente exigem amostragem sanguínea invasiva ou técnicas complexas de isótopos estáveis. A quantificação de ferro fecal oferece uma alternativa não invasiva, uma vez que o ferro não absorvido é excretado nas fezes; contudo, métodos padronizados e validados para quantificar o ferro fecal em amostras de fezes infantis de pequeno volume não estão rotineiramente estabelecidos na pesquisa de microbioma ou probióticos.

Metodologia
Este estudo compreendeu duas partes distintas conduzidas em Dhaka, Bangladesh:

1. Otimização e Validação do Ensaio (Parte A):

   • Objetivo: Otimizar e validar um método de espectrometria de absorção atômica (AAS) para quantificar o ferro em fezes infantis.
   • Amostras: As amostras de fezes foram agrupadas (pooled) de uma coorte observacional (SEPSiS) de lactentes com 0–64 dias de vida. Alíquotas foram liofilizadas, calcinadas em um forno mufla (até 600°C) e reconstituídas em ácido clorídrico.
   • Validação: O ensaio foi testado quanto à exatidão (usando padrões e amostras enriquecidas), precisão (coeficientes de variação intra e inter-corrida), recuperação e limites de detecção (LOD) e de quantificação (LLOQ).
   • Teste Piloto: O ensaio otimizado foi aplicado a 32 amostras de fezes agrupadas, estratificadas por idade, estado de alimentação, sexo e status nutricional neonatal, para explorar variações no ferro fecal.

2. Subestudo de Ensaio Clínico Randomizado (RCT) (Parte B):

   • Desenho: Um subestudo aninhado dentro de um RCT controlado por placebo (ensaio SEPSiS LP, NCT051801201).
   • Participantes: 307 recém-nascidos (0–4 dias de idade) foram randomizados em cinco grupos: Placebo, 1 dia de L. plantarum (LP1), 1 dia de LP + FOS (LP1+FOS), 7 dias de LP (LP7) e 7 dias de LP + FOS (LP7+FOS).
   • Intervenção: Os lactentes receberam 10⁹ CFU de L. plantarum ATCC 202195, com ou sem 150 mg de frutooligossacarídeo (FOS), ou placebo, administrados oralmente uma vez ao dia por 1 ou 7 dias.
   • Desfechos:
     • Primário: Concentração de ferro fecal medida aos 14 dias de idade pós-natal (n=307) utilizando o ensaio AAS otimizado.
     • Secundário: Concentração de ferritina sérica medida aos 60 dias de idade pós-natal (n=251).
   • Análise: Modelos de regressão linear foram usados para estimar as diferenças percentuais médias de desfechos transformados em log em relação ao placebo, com ajustes para covariáveis em análises suplementares.

Principais Contribuições

• Desenvolvimento Metodológico: O estudo adaptou e validou com sucesso um protocolo de AAS especificamente para amostras de fezes infantis liofilizadas de baixa massa. O ensaio demonstrou exatidão aceitável (91–99%), precisão (CV <10%) e recuperação (93–112%), com uma faixa de detecção de 0,2 a 80 mg Fe/100g de fezes secas.
• Demonstração de Viabilidade: O artigo demonstra a aplicação prática deste biomarcador não invasivo em um ambiente rigoroso de RCT, utilizando amostras de fezes coletadas para outros fins de microbioma.
• Evidência Empírica: Fornece os primeiros dados sobre o efeito da administração de L. plantarum ATCC 202195 (com ou sem FOS) sobre o ferro fecal e a ferritina sérica na primeira infância (0–2 meses).

Resultados

• Desempenho do Ensaio: O ensaio AAS otimizado foi robusto. Na coorte piloto, as concentrações de ferro fecal variaram conforme a idade e o estado de alimentação, sendo significativamente menores em lactentes em aleitamento materno exclusivo (AME) em comparação com aqueles com amamentação parcial ou ausente.
• Achados do RCT (Ferro Fecal): Não houve diferença estatisticamente significativa nas concentrações de ferro fecal aos 14 dias entre os grupos de intervenção e o grupo placebo.
  • Regime de 1 dia: % de diferença = 9,8% (95% CI: -19%, 49%; P=0,54).
  • Regime de 7 dias: % de diferença = -6,1% (95% CI: -31%, 28%; P=0,69).
  • A desagregação pela coadministração de FOS resultou em resultados nulos semelhantes.
• Achados do RCT (Ferritina Sérica): Da mesma forma, não houve efeitos significativos dos regimes de 1 ou 7 dias nas concentrações de ferritina sérica aos 60 dias de idade (P > 0,05 para todas as comparações).
• Análise de Subgrupo: O ferro nas fezes foi significativamente menor em lactentes em AME comparados a lactentes não em AME, o que é consistente com o menor teor de ferro no leite humano em comparação com fórmulas fortificadas. No entanto, o status de amamentação, sexo, modo de parto e peso ao nascer não modificaram significativamente o efeito da intervenção no ferro fecal.

Significância e Alegações
Os autores concluem que a quantificação de ferro fecal via AAS é um método válido e viável para uso em ensaios neonatais, oferecendo uma alternativa não invasiva à amostragem sanguínea. No entanto, o estudo afirma explicitamente que o método é intensivo em recursos (exigindo liofilização e calcinação) e pode não fornecer dados mais informativos do que os marcadores convencionais de status de ferro (como a ferritina sérica) ao avaliar o impacto de probióticos/simbióticos na biodisponibilidade do ferro neste contexto específico.

O artigo alega que a administração de L. plantarum ATCC 202195, com ou sem FOS, por 1 ou 7 dias nas primeiras semanas de vida, não influenciou as medidas precoces de ferro fecal ou o status de ferro (ferritina) aos 2 meses. Os autores sugerem que a falta de efeito pode ser devida à cepa específica utilizada, à curta duração da administração, à ausência de ferro exógeno coadministrado ou à regulação fisiológica da absorção de ferro em lactentes com estoques de ferro pré-natais suficientes. Eles postulam que, embora o ensaio seja uma ferramenta útil, pesquisas adicionais utilizando técnicas de isótopos estáveis podem ser necessárias para refletir diretamente a absorção de ferro em estudos futuros de interações entre probióticos e ferro.