Thin layer chromatographic detection of chlorpyrifos in human biological fluids using low-cost chromogenic reagent

Resumo Técnico: Detecção de Clorpirifós em Fluidos Biológicos Humanos por Cromatografia em Camada Delgada Utilizando um Reagente Cromogênico de Baixo Custo

Definição do Problema
O clorpirifós, um inseticida organofosforado amplamente utilizado na agricultura, representa um risco significativo à saúde pública devido ao seu envolvimento em casos de envenenamento acidental, suicida e homicida. A toxicidade grave pode levar à depressão respiratória, convulsões e morte. Embora técnicas analíticas avançadas, como a Cromatografia Gasosa–Espectrometria de Massas (GC-MS), Cromatografia Líquida–Espectrometria de Massas (LC-MS) e Cromatografia em Camada Delgada de Alta Performance (HPTLC), ofereçam alta sensibilidade e especificidade, elas são frequentemente caras, tecnicamente exigentes e inacessíveis em laboratórios clínicos e forenses com recursos limitados. Os métodos existentes de Cromatografia em Camada Delgada (TLC) para a detecção de clorpirifós têm dependido de reagentes como o cloreto de paládio (caro) ou nitrato de mercuroso (altamente tóxico). Há uma necessidade de um método de triagem simples, rápido, confiável e de baixo custo, adequado para análise toxicológica preliminar em fluidos biológicos como sangue e aspirado gástrico.

Metodologia
O estudo desenvolveu um método de TLC qualitativo e semiquantitativo utilizando uma solução de sulfato de cobre a 10% como um novo reagente cromogênico de baixo custo.

• Preparação da Amostra: Amostras biológicas (sangue e aspirado gástrico) foram coletadas de pacientes com históricos clínicos sugestivos de ingestão de clorpirifós. O clorpirifós foi extraído por meio de extração líquido-líquido com éter dietílico. As amostras de sangue foram primeiramente tratadas com tungstato de sódio e ácido sulfúrico para precipitar as proteínas antes da extração.
• Condições Cromatográficas: A separação foi realizada em placas de sílica gel pré-revestidas (Sílica gel 60 F254). A fase móvel utilizada foi hexano–acetona (8:2, v/v).
• Visualização: Após o desenvolvimento, as placas foram pulverizadas com uma solução de sulfato de cobre pentahidratado a 10%.
• Validação e Análise: O método foi validado quanto à repetibilidade e especificidade contra outros inseticidas organofosforados, piretroides e herbicidas. A análise semiquantitativa foi conduzida utilizando o software ImageJ para medir as áreas dos picos das manchas. Uma curva de calibração foi construída plotando a quantidade de clorpirifós padrão (µg/mancha) contra a área do pico. Os Limites de Detecção (LOD) e de Quantificação (LOQ) foram calculados utilizando o desvio padrão e a inclinação da curva de calibração.

Principais Contribuições

• Aplicação de Novo Reagente: O estudo introduz o sulfato de cobre a 10% como um reagente cromogênico seletivo para o clorpirifós, oferecendo uma alternativa menos tóxica e mais econômica ao cloreto de paládio ou nitrato de mercuroso.
• Seletividade: O reagente produziu uma mancha amarela distinta especificamente para o clorpirifós (Rf = 0,86). Embora outros organofosforados como quinalfos, dimetoato e triazofos tenham mostrado alguma resposta de cor, o clorpirifós demonstrou a reação mais característica e intensa, permitindo uma triagem direcionada.
• Integração Digital: A integração do software ImageJ para análise de imagem permitiu uma avaliação semiquantitativa objetiva da intensidade da mancha, superando a subjetividade da observação visual.
• Aplicabilidade a Fluidos Biológicos: O método foi aplicado com sucesso em amostras clínicas reais (sangue e aspirado gástrico) de casos de envenenamento, demonstrando sua utilidade na toxicologia clínica e forense.

Resultados

• Identificação: O clorpirifós produziu uma mancha de cor amarela distinta com um valor de Rf de 0,86, que coincidiu exatamente com os resíduos extraídos das amostras desconhecidas de sangue e aspirado gástrico.
• Repetibilidade: O método mostrou alta reprodutibilidade com valores de Rf variando apenas em ±0,01 em cinco ensaios.
• Sensibilidade: O Limite de Detecção (LOD) foi calculado em 3,8025 µg/mancha, e o Limite de Quantificação (LOQ) em 11,5229 µg/mancha.
• Quantificação: Uma curva de calibração com uma equação de regressão de y = 70,86x + 2359 e um valor de R² de 0,952 indicou linearidade satisfatória.
  • O conteúdo estimado de clorpirifós em uma amostra de sangue desconhecida foi de 327,2416 µg/mancha.
  • O conteúdo estimado em uma amostra de aspirado gástrico desconhecida foi de 168,9368 µg/mancha.
• Especificidade: Entre os pesticidas testados, apenas o clorpirifós, quinalfos, dimetoato, triazofos e dicloreto de paraquat mostraram respostas de cor, sendo o clorpirifós o mais distinto. A maioria dos outros organofosforados, piretroides e herbicidas testados não apresentou cor visível.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo estabelece com sucesso um método baseado em TLC simples, rápido, confiável e de baixo custo para a triagem preliminar de envenenamento por clorpirifós. O uso do sulfato de cobre como reagente cromogênico torna a técnica particularmente valiosa para ambientes com recursos limitados, onde instrumentação avançada não está disponível. O método é apresentado como uma ferramenta de triagem, e não como um teste confirmatório definitivo; os autores declaram explicitamente que achados positivos devem idealmente ser confirmados por métodos avançados como GC-MS ou HPLC para quantificação precisa. O estudo enfatiza que o método desenvolvido pode auxiliar na identificação rápida de clorpirifós em laboratórios clínicos e forenses, potencialmente auxiliando no salvamento de vidas de pacientes envenenados através da detecção oportuna.