Resumo Técnico: Morte Celular por Apoptose de Células de Câncer de Bexiga Humano via Jato de Plasma Atmosférico de Hélio Impulsionado por CA de Alta Voltagem

Declaração do Problema

Os Plasmas Atmosféricos Frios (CAPs) emergiram como uma ferramenta promissora para a terapia do câncer, utilizando Espécies Reativas de Oxigênio e Nitrogênio (RONS) para induzir a parada do ciclo celular e a apoptose. No entanto, os Jatos de Plasma Atmosférico (APPJs) existentes utilizados em estudos anteriores frequentemente dependiam de altas voltagens pulsadas em microssegundos, que produziam plumas de plasma curtas. Essas plumas curtas apresentam desafios para a aplicação clínica devido ao risco de choque elétrico e dificuldades na padronização das dosagens de tratamento. Além disso, embora os CAPs mostrem eficácia em vários tipos de câncer, sua aplicação específica ao câncer de bexiga permanece subinvestigada. Há uma necessidade de estabelecer uma fonte de plasma de baixa temperatura estável, com um comprimento de pluma controlável, para tratar efetivamente células de câncer de bexiga, particularmente aquelas que são quimioresistentes, além de compreender a correlação entre os parâmetros do plasma (voltagem, fluxo de gás, composição) e os desfechos biológicos.

Metodologia

O estudo empregou um APPJ de hélio de pressão atmosférica, impulsionado sinusoidalmente (21 kHz) por alta voltagem, construído customizadamente.

• Fonte de Plasma: O dispositivo utilizou um eletrodo de agulha (aço inoxidável) dentro de um tubo de quartzo com um eletrodo de aterramento de anel de cobre externo. O gás hélio foi fluído em taxas entre 1 a 6 litros padrão por minuto (slm), com voltagens aplicadas variando de 10 a 14 kVpp.
• Caracterização: As propriedades do plasma foram analisadas via espectroscopia de emissão óptica (200–900 nm) para identificar RONS (ex: OH, N2, O) e um detector de ozônio para medir o ozônio na fase gasosa. A temperatura da pluma e a corrente de descarga também foram monitoradas.
• Modelos Celulares: Duas linhagens de células de câncer de bexiga humana foram utilizadas: T24 e 5637. Adicionalmente, variantes de gemcitabina-resistentes dessas células foram testadas para avaliar a eficácia contra fenótipos quimioresistentes.
• Protocolo Experimental: As células foram expostas ao plasma por durações de 5, 10, 30 e 60 segundos.
• Ensaios:
  • Viabilidade: Medida via ensaio MTT em 0, 24 e 48 horas pós-tratamento.
  • ROS Intracelular: Quantificado usando coloração de fluorescência DCFDA e citometria de fluxo/leitura de microplaca.
  • Apoptose: Avaliada via coloração com Anexina V-FITC/Propidium Iodide (PI) e citometria de fluxo para distinguir células em apoptose precoce e tardia.
  • Composição Gasosa: Os experimentos compararam o fluxo de hélio puro contra hélio suplementado com oxigênio (10 sccm O₂).

Resultados Principais

1. Características do Plasma: O APPJ gerou uma pluma estável de baixa temperatura (próxima à temperatura ambiente) com uma potência média de aproximadamente 9 W. A espectroscopia de emissão óptica confirmou a presença de espécies reativas, incluindo radicais OH, N2, N2+ e oxigênio atômico. A produção de ozônio aumentou tanto com a voltagem aplicada quanto com a taxa de fluxo de hélio, embora as taxas de fluxo acima de 2 slm tenham sido evitadas para prevenir fluxo turbulento e instabilidade da superfície líquida.
2. Citotoxicidade: O tratamento com plasma reduziu significamente a viabilidade de células de câncer de bexiga T24 e 5637 de maneira dependente do tempo. Uma redução estatisticamente significativa na viabilidade foi observada após apenas 5 segundos de exposição. O efeito citotóxico também foi dependente da voltagem, com voltagens mais altas (14 kVpp) causando maior morte celular do que voltagens menores (10 kVpp).
3. Geração de ROS: Os níveis de ROS intracelular aumentaram significativamente após a exposição ao plasma. Nas células 5637, um aumento significativo foi detectado após 30 segundos, enquanto as células T24 mostraram um aumento significativo já aos 10 segundos, indicando sensibilidades ao estresse oxidativo específicas de cada linhagem celular.
4. Indução de Apoptose: A redução na viabilidade celular foi confirmada como mediada pela apoptose. A citometria de fluxo revelou um aumento dependente do tempo tanto nas populações de apoptose precoce quanto na tardia. Exposições mais curtas favoreceram a apoptose precoce, enquanto exposições mais longas (60 s) deslocaram o equilíbrio para a apoptose tardia.
5. Efeito da Suplementação de Oxigênio: A adição de oxigênio ao fluxo de hélio (He + O₂) aumentou significativamente a indução de apoptose em comparação ao plasma de hélio puro em ambas as linhagens celulares.
6. Células Quimioresistentes: Células de câncer de bexiga resistentes à gemcitabina exibiram ainda maior sensibilidade ao tratamento com plasma do que suas contrapartes parentais. A combinação de hélio e oxigênio foi particularmente eficaz em induzir a apoptose nessas células resistentes.

Contribuições Principais

• Otimização do Dispositivo: O estudo implementou com sucesso um APPJ de CA sinusoidal impulsionado por alta voltagem que produz uma pluma mais longa e estável à temperatura ambiente, abordando problemas de segurança e padronização associados aos jatos de potência pulsada anteriores.
• Correlação de Parâmetros: Estabeleceu uma clara correlação entre os parâmetros operacionais do plasma (voltagem, taxa de fluxo, composição gasosa) e os desfechos biológicos (viabilidade, ROS, apoptose) em células de câncer de bexiga.
• Superação da Quimioresistência: A pesquisa demonstrou que a terapia com plasma, particularmente com suplementação de oxigênio, pode visar efetivamente células de câncer de bexiga quimioresistentes, sugerindo um mecanismo distinto da quimioterapia convencional.
• Insight Mecanístico: O estudo reforçou o papel do acúmulo de ROS intracelular como um mediador primário da apoptose induzida pelo plasma no câncer de bexiga.

Significância e Alegações

Os autores afirmam que este estudo destaca o potencial terapêutico do APPJ de CA de alta voltagem enriquecido com oxigênio como uma estratégia para tratar o câncer de bexiga convencional e o refratário à quimioterapia. O artigo postula que a terapia com plasma supera a quimioresistência através de mecanismos mediados por ROS que diferem dos agentes citotóxicos padrão. Ao demonstrar que as células quimioresistentes são mais suscetíveis ao estresse oxidativo induzido pelo plasma do que as células parentais, o trabalho sugere que os CAPs podem servir como uma alternativa viável ou adjuvante para o tratamento do câncer de bexiga refratário. O estudo enfatiza que a determinação precisa da dosagem do plasma (via controle de voltagem e fluxo) é essencial para otimizar a eficácia terapêutica, minimizando danos celulares desnecessários.