Release rates and adhesion properties of biofilm-released Staphylococcus aureus SA113 cells cultured under constant flow

Definição do Problema
As infecções associadas a implantes (IAIs) causadas por Staphylococcus aureus representam uma carga significativa para a saúde global, frequentemente originadas da formação de biofilmes em dispositivos médicos. Embora o ciclo de vida geral dos biofilmes (adesão, maturação, dispersão) seja compreendido, a dinâmica específica da liberação de células e as propriedades de adesão resultantes das células liberadas sob condições de fluxo realistas permanecem incompletamente caracterizadas. Estudos anteriores utilizaram modelos estáticos ou modelos de fluxo dinâmico com diferentes tensões de cisalhamento e leituras, levando a observações conflitantes sobre as fases de liberação (por exemplo, liberação contínua vs. fases distintas de "êxodo"). Além disso, não está claro como o potencial de adesão das células liberadas de um biofilme se compara às células planctônicas, particularmente durante os estágios iniciais do desenvolvimento do biofilme sob fluxo.

Metodologia
Os autores desenvolveram um ensaio de fluxo de biofilme resolvido no tempo utilizando um sistema de microplacas ibidi para cultivar S. aureus cepa SA133 sob condições de fluxo constante (1 mL/min, ~3,49 dyn·cm⁻² de tensão de cisalhamento) durante 24 horas.

• Quantificação da Liberação: Unidades formadoras de colônias (CFUs) de células liberadas do biofilme foram quantificadas a cada hora durante as primeiras 8 horas e às 24 horas. As amostras foram sonicadas para dispersar aglomerados celulares antes do plaqueamento.
• Análise de Adesão: A espectroscopia de força de célula única (SCFS) foi empregada para medir forças de adesão e comprimentos de ruptura. Sondas bacterianas foram preparadas a partir de três populações distintas: (1) células planctônicas na fase exponencial, (2) células liberadas de biofilmes após 2 horas e (3) células liberadas após 24 horas.
• Substratos: A adesão foi testada em três substratos: dióxido de silício (SiO₂) hidrofílico, octadeciltriclorosilano (OTS) hidrofóbico e tubulação de políretano (PVC) baseada em cateter venoso periférico, clinicamente relevante.
• Controles: O estudo utilizou a cepa SA133, selecionada por sua robusta capacidade de formação de biofilme, enquanto reconheceu seu background genético específico (mutações em agr e rsbU).

Resultados Principais

• Dinâmica de Liberação: Contrariamente aos modelos que propõem fases de liberação distintas e separadas (como a fase de "êxodo" ocorrendo apenas após 6–8 horas), o estudo observou uma liberação contínua de células viáveis durante todo o período de observação. As taxas de liberação permaneceram constantes na primeira hora (1,05 × 10⁵ CFU·mL⁻¹·min⁻¹), aumentaram significativamente às 2 horas (1,9 × 10⁶ CFU·mL⁻¹·min⁻¹) e seguiram um aumento linear até as 8 horas, continuando a subir às 24 horas. Os autores atribuem a discrepância com modelos anteriores às diferenças na tensão de cisalhamento (3,5 dyn·cm⁻² vs. 0,6 dyn·cm⁻²) e ao background genético específico da cepa utilizada.
• Propriedades de Adesão (Precoce vs. Tardia): A SCFS revelou uma população heterogênea de células liberadas com perfis de adesão distintos:
  • Liberação Precoce (2 h): Células liberadas após 2 horas exibiram forças de adesão significativamente maiores e comprimentos de ruptura mais longos em comparação com células planctônicas em todos os substratos testados (PVC, OTS, SiO₂). No PVC, a força de adesão média foi de 7,40 nN (vs. 2,00 nN para planctônicas), e os comprimentos de ruptura foram de 678 nm (vs. 383 nm).
  • Liberação Tardia (24 h): Células liberadas após 24 horas exibiram propriedades de adesão comparáveis às células da fase exponencial planctônica, com forças médias e comprimentos de ruptura retornando aos níveis basais.
• Especificidade do Substrato: A adesão aumentada das células liberadas precocemente foi mais pronunciada em superfícies hidrofóbicas (PVC e OTS), consistente com a regulação positiva de adesinas e componentes da matriz extracelular durante o desenvolvimento inicial do biofilme. Em SiO₂ hidrofílico, as células de estágio tardio (24 h) mostraram uma adesão ligeiramente superior às de estágio inicial, potencialmente devido a mudanças na expressão gênica favorecendo a produção de toxinas em detrimento de adesinas de superfície.

Significância e Alegações
O artigo afirma fornecer a primeira avaliação quantitativa das forças de adesão e comprimentos de ruptura de células de S. aureus liberadas de biofilmes cultivados sob condições de fluxo, comparadas diretamente com células planctônicas. A principal significância reside em demonstrar que as células liberadas do biofilme não são uma população homogênea. Especificamente, células liberadas durante os estágios iniciais do desenvolvimento do biofilme possuem um "potencial de adesão excepcionalmente alto". Os autores sugerem que este fenótipo distinto provavelmente promove a colonização eficiente de superfícies secundárias sob fluxo, desempenhando um papel direto na propagação de infecções associadas a implantes. O estudo destaca que a dinâmica do biofilme, particularmente os padrões de liberação, é altamente dependente de leituras experimentais, genética da cepa bacteriana e condições hidrodinâmicas.

Limitações Notadas pelos Autores
Os autores reconhecem que a cepa SA133 carrega mutações em agr e rsbU, que podem alterar a cinética de liberação em comparação com cepas selvagens (wild-type). Além disso, a etapa de sonicação necessária para preparar suspensões de célula única para SCFS pode ter removido parcialmente componentes da matriz extracelular, levando potencialmente a estimativas conservadoras das forças de adesão. Por fim, o uso de meio TSB carece de fatores hospedeiros (como proteínas do plasma sanguíneo) presentes em ambientes clínicos.