Divergent Functions of Two AGL6 Homologs in Floral Meristem Transition and Organ Morphogenesis in London Plane Tree

Resumo Técnico: Funções Divergentes de Dois Homólogos de AGL6 em Platanus acerifolia

Definição do Problema
A subclasse AGAMOUS-LIKE 6 (AGL6) representa um clado antigo de fatores de transcrição MADS-box críticos para o desenvolvimento floral, frequentemente atuando como genes de classe E junto com proteínas SEPALLATA (SEP). Embora as funções dos homólogos de AGL6 tenham sido caracterizadas em espécies herbáceas modelo (ex: Arabidopsis, arroz, petúnia) e alguns angiospermas basais, suas funções em eudicotiledôneas lenhosas permanecem amplamente desconhecidas. Especificamente, o plátano (Platanus acerifolia), um membro da ordem Proteales, carece de verificação experimental das funções de seus genes AGL6. Além disso, a ausência de um gene FLC canônico em Platanus obscurece a rede regulatória em torno de AGL6 nesta espécie. Este estudo aborda a lacuna na compreensão de como os homólogos de AGL6 regulam a transição do meristema floral, a morfogênese de órgãos e a arquitetura vegetativa em uma árvore lenhosa não-modelo.

Metodologia
Os pesquisadores empregaram uma abordagem multifacetada combinando clonagem molecular, análise filogenética, perfil de expressão e genética funcional:

• Identificação de Genes e Filogenia: Dois genes do tipo AGL6, PlacAGL6a e PlacAGL6b, foram clonados de P. acerifolia utilizando dados de transcriptoma. As sequências codificantes de comprimento total foram analisadas quanto à estrutura de domínio (tipo MIKC) e motivos. Árvores filogenéticas foram construídas usando métodos de Máxima Verossimilhança com homólogos de gimnospermas, monocotiledôneas e eudicotiledôneas.
• Análise de Expressão Espaciotemporal: A qRT-PCR foi realizada em tecidos de árvores juvenis (2 anos) e maduras (>30 anos). As amostras incluíram órgãos vegetativos (raízes, caules, folhas, botões) e tecidos reprodutivos (inflorescências, frutos) através de vários estágios de desenvolvimento de junho ao próximo abril.
• Caracterização Funcional em Arabidopsis: Para avaliar a função, cDNAs de PlacAGL6a e PlacAGL6b foram constitutivamente superexpressos em Arabidopsis thaliana (Col-0) sob o promotor CaMV 35S. Linhagens transgênicas foram triadas para mudanças fenotípicas no tempo de floração, morfologia foliar e ramificação.
• Análise Transcriptômica de Transgênicos: A qRT-PCR foi usada para quantificar a expressão de reguladores chave de floração (AP1, LFY, FT, TFL1, SOC1, FLC, CO) e genes de desenvolvimento foliar (GRF1/2/5, ARF2, TCP3/18/20) em linhagens transgênicas comparadas ao tipo selvagem.
• Interação Proteína-Proteína (Y2H): Ensaios de duplo híbrido em levedura foram conduzidos para testar interações entre proteínas PlacAGL6 e vários parceiros de classe MADS-box (classes A, B, C, D e E) de Platanus, bem como capacidades de homodimerização.

Principais Resultados

• Estrutura Gênica e Evolução: PlacAGL6a e PlacAGL6b codificam proteínas do tipo MIKC com motivos AGL6-I e AGL6-II conservados. Eles compartilham alta identidade de sequência (88,8% de nucleotídeos, 86,9% de aminoácidos), mas estão localizados em cromossomos diferentes sem duplicação em tandem. A análise filogenética confirma seu posicionamento dentro de um clado AGL6 conservado compartilhado por gimnospermas e angiospermas.
• Padrões de Expressão: Ambos os genes são expressos exclusivamente em tecidos reprodutivos (inflorescências e frutos) e estão ausentes em tecidos vegetativos de árvores tanto juvenis quanto maduras. A expressão inicia-se em botões subpetiolares durante a diferenciação da inflorescência (junho) e atinge o pico durante o desenvolvimento floral. Notavelmente, a expressão de PlacAGL6b aumenta dramaticamente em março (pré-antese), superando a de PlacAGL6a, e é localizada principalmente em pedúnculos carnosos, enquanto PlacAGL6a também é detectado em anteras.
• Efeitos Fenotípicos em Arabidopsis: A expressão constitutiva de ambos os genes resultou em floração precoce (emissão de estolho após 5–6 folhas de roseta), folhas em formato de tira e curvadas, e aumento na ramificação lateral.
  • Transgênicos de PlacAGL6b exibiram defeitos de órgãos florais únicos, incluindo sépalas e pétalas verde-claras, sugerindo um papel específico na identidade dos órgãos.
  • Transgênicos de PlacAGL6a não apresentaram essas mudanças específicas na cor floral.
• Mecanismos Moleculares:
  • A superexpressão regulou positivamente genes de identidade de meristema floral (AP1, LFY, FT, TFL1) e reguladores de botões axilares (TCP18/BRC1), correlacionando-se com floração precoce e aumento de ramificação.
  • O enrolamento foliar foi associado à alteração na expressão de genes de proliferação celular (famílias GRF e TCP).
  • Divergência de Interação: Ensaios de duplo híbrido em levedura revelaram perfis de interação distintos. PlacAGL6a pode formar homodímeros e interagir com proteínas de classe C (PlacAG), classe D (PlacSTK1/2) e classe B (PlacPI2a). Em contraste, PlacAGL6b não forma homodímeros e carece de interação com proteínas de classes C e D, embora ambos interajam com proteínas SEP.

Principais Contribuições
Este estudo fornece a primeira caracterização funcional abrangente dos genes da subclasse AGL6 em uma eudicotiledônea lenhosa basal. Os autores lograram:

1. Identificar e caracterizar dois paralogos AGL6 de Platanus (PlacAGL6a/b).
2. Demonstrar que estes genes carecem de expressão vegetativa, apoiando a hipótese de que a expressão vegetativa de AGL6 foi perdida em eudicotiledôneas basais e potencialmente recuperada mais tarde na evolução das eudicotiledôneas núcleo.
3. Revelar a divergência funcional entre os dois paralogos: enquanto ambos promovem a floração e a ramificação (funções redundantes), PlacAGL6a retém capacidades ancestrais de interagir com proteínas de classes C e D para a especificação de órgãos reprodutivos, enquanto PlacAGL6b adquiriu papéis distintos na morfogênese de órgãos florais (evidenciado por seus efeitos fenotípicos únicos e perfil de interação).

Significância e Alegações
O artigo afirma oferecer novos insights sobre os papéis biológicos dos fatores de transcrição MADS-box em P. acerifolia. Os achados sugerem que PlacAGL6a e PlacAGL6b possuem funções tanto redundantes quanto distintas na transição do meristema floral, morfogênese de órgãos florais e ramificação do caule. O estudo destaca que, apesar de padrões de expressão semelhantes, a duplicação gênica levou à divergência funcional, com PlacAGL6a potencialmente retendo funções ancestrais de classe E (via interações com classes C/D) e PlacAGL6b evoluindo papéis especializados no desenvolvimento de órgãos florais. Estes resultados avançam a compreensão da evolução de AGL6 em espécies lenhosas e fornecem recursos genéticos para o melhoramento molecular de plátanos e outras ornamentais lenhosas. Os autores notam modestamente que, embora suspeitem que genes do tipo AGL6 possam geralmente carecer de expressão vegetativa em eudicotiledôneas basais, estudos adicionais são necessários para confirmar essa tendência evolutiva.