Evaluation of artificial inoculation methods for phenotyping of bacterial spot disease in almond

Resumo Técnico: Avaliação de Métodos de Inoculação Artificial para Fenotipagem da Mancha Bacteriana em Amendoeira

Definição do Problema
A mancha bacteriana, causada por Xanthoma arboricola pv. pruni (Xap), é uma doença significativa que afeta a produção de amendoeira (Prunus dulcis), causando perdas econômicas através da redução do vigor das árvores, do rendimento e da qualidade da noz. Embora a resistência da planta hospedeira seja uma estratégia de manejo sustentável, seu desenvolvimento é dificultado pela falta de métodos de fenotipagem confiáveis. A infecção natural é difícil de avaliar devido à confusão de sintomas com outras doenças ou danos abióticos, e a triagem baseada em frutos é impraticável para as fases iniciais de melhoramento devido ao longo período juvenil das árvores de amendoeira. Além disso, há pesquisas limitadas avaliando como diferentes técnicas de inoculação artificial, cepas de Xap e métodos de avaliação de severidade da doença interagem para afetar a precisão da fenotipagem em amendoeira. Este estudo aborda a necessidade de identificar métodos adequados e reprodutíveis para a triagem de germoplasma de amendoeira para resistência à mancha bacteriana.

Metodologia
A pesquisa foi conduzida durante a primavera e o início do verão de 2024 e 2025 no Campus Waite da Universidade de Adelaide. O estudo utilizou quatro cultivares de amendoeira (Carmel, Fritz, Marcona e Nonpareil) e duas cepas de Xap (DAR 72009 e DAR 82623) a uma concentração de inóculo de aproximadamente $10^7$ CFU/mL.

Cinco métodos de inoculação artificial foram avaliados em diferentes ambientes (laboratório, casa de sombra e pomar):

1. Seringa sem agulha: Infiltração de folhas destacadas usando um corpo de seringa sem agulha.
2. Picada ou arranhão com agulha: Ferimento de folhas destacadas com uma agulha ou arranhão, seguido pela aplicação de gotículas de inóculo.
3. Broto Destacado: Inoculação de brotos cortados colocados em meio de cultura dentro de uma câmara úmida.
4. Broto Preso: Inoculação de folhas em árvores intactas em uma casa de sombra ou pomar.
5. Pulverização: Aplicação foliar de inóculo em árvores intactas no pomar, com e sem ferimento mecânico prévio.

A severidade da doença foi avaliada utilizando quatro métricas: porcentagem de área foliar doente, diâmetro da lesão, uma pontuação de severidade de cinco níveis e o número de sítios infectados. A reisolação do patógeno e a confirmação por PCR foram realizadas para validar os postulados de Koch. Os dados foram analisados por meio de ANOVA e modelos lineares mistos.

Principais Resultados

• Indução de Sintomas: Todos os cinco métodos de inoculação e ambas as cepas de Xap induziram com sucesso sintomas de mancha bacteriana em todas as quatro cultivares. Nenhuma das cultivares testadas exibiu resistência; todas foram suscetíveis.
• Desempenho do Método de Inoculação:
  • Velocidade: O método do broto destacado produziu sintomas mais rapidamente (3–6 dias), seguido pela seringa sem agulha (6–14 dias). O método de pulverização foi o mais lento (28 dias).
  • Confiabilidade: A seringa sem agulha, a pulverização e o método do broto preso foram identificados como os mais promissores para fenotipagem. O método do broto destacado foi limitado pela senescência foliar rápida (dentro de 14 dias), e o método de picada/arranhão com agulha resultou em lesões subdesenvolvidas e amarelecimento significativo das folhas até o dia 21, confundindo a avaliação da severidade.
  • Influência Ambiental: O desenvolvimento dos sintomas variou conforme o ambiente. O método do broto preso mostrou desenvolvimento de sintomas mais rápido em 2025 comparado a 2024, provavelmente devido a condições favoráveis de chuva e microclima. O método de pulverização produziu sintomas mais semelhantes às infecções naturais de campo, mas foi altamente dependente das condições ambientais e propenso a interferências de outras pragas e doenças.
• Avaliação de Severidade:
  • Porcentagem de Área Foliar Doente: Esta foi a única métrica aplicável e consistente entre todos os cinco métodos de inoculação para diferenciar as respostas das cultivares.
  • Diâmetro da Lesão e Sítios Infectados: Estas métricas mostraram potencial para diferenciar respostas com métodos específicos (ex: broto preso), mas foram impraticáveis para o método de pulverização devido à coalescência e ao pequeno tamanho das lesões.
  • Pontuações de Severidade: A escala qualitativa de cinco níveis mostrou-se menos eficaz devido à dificuldade em distinguir os estágios das lesões e à presença de amarelecimento.
• Interações entre Cepa e Cultivar: Embora a DAR 82623 tenha causado, em geral, doença mais severa que a DAR 72009, os efeitos da cepa nem sempre foram estatisticamente significativos. As respostas das cultivares variaram entre condições controladas e de campo; por exemplo, a Nonpareil pareceu ser a mais suscetível em ensaios de broto preso em campo, apesar de mostrar menor suscetibilidade em ensaios de folhas destacadas.

Principais Contribuições
O estudo fornece uma avaliação comparativa de cinco técnicas de inoculação e quatro métricas de severidade especificamente para a mancha bacteriana em amendoeira. Estabelece que:

1. Seleção de Método: O método da seringa sem agulha é adequado para triagem rápida e de alto rendimento em condições controladas. O método do broto preso oferece uma alternativa viável para a avaliação de resistência em pequena escala no campo, enquanto o método de pulverização é o mais apropriado para fenotipagem relevante de campo, apesar de suas dependências ambientais.
2. Seleção de Métrica: A porcentagem de área foliar doente é o indicador de severidade mais robusto entre diversos métodos de inoculação.
3. Suscetibilidade da Cultivar: O estudo confirma que as quatro principais cultivares testadas (Carmel, Fritz, Marcona, Nonpareil) são atualmente suscetíveis à mancha bacteriana, destacando a necessidade de esforços contínuos de melhoramento.

Significância e Alegações
O artigo afirma fornecer orientação prática para melhoristas na seleção de métodos de fenotipagem para resistência à mancha bacteriana em amendoeira. Enfatiza que a escolha do método deve equilibrar precisão, praticidade e os objetivos específicos do programa de melhoramento (ex: triagem controlada vs. validação de campo). Os autores concluem modestamente que, embora os métodos testados permitam a coleta de dados quantitativos, é necessária uma avaliação adicional com ensaios de campo replicados e uma gama mais ampla de isolados de Xap para determinar definitivamente o status de resistência das cultivares de amendoeira. Eles sugerem que estudos futuros poderiam se beneficiar de análise baseada em imagens para melhorar a precisão da estimativa de severidade da doença, particularmente em níveis de baixa severidade.