Exploratory small RNA sequencing of human placental miRNAs identifies candidates associated with congenital transmission of Trypanosoma cruzi

Resumo Técnico: Sequenciamento Exploratório de Pequenos RNAs de MicroRNAs Placentários Humanos na Transmissão Congênita de Trypanosoma cruzi

Definição do Problema
A transmissão congênita de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas, continua sendo uma fonte significativa de novas infecções, particularmente entre populações migrantes de mulheres em idade reprodutiva cronicamente infectadas. Embora o diagnóstico precoce e o tratamento de neonatos sejam altamente eficazis, a triagem atual depende de testes parasitológicos e moleculares sequenciais ao longo de vários meses, o que frequentemente leva a um atraso na identificação. Os mecanismos moleculares que regem a passagem transplacentária do parasita são mal compreendidos. Especificamente, o papel dos microRNAs (miRNAs) placentários — reguladores fundamentais da expressão gênica, sinalização imunológica e desenvolvimento placentário — na modulação da suscetibilidade à transmissão congênita ainda não foi caracterizado em gestações humanas naturalmente infectadas. Evidências prévias existem de modelos de explante placentário ex vivo, mas faltavam perfis de mães naturalmente infectadas, estratificadas por status de transmissão, in vivo.

Metodologia
Este estudo empregou um delineamento exploratório utilizando sequenciamento de pequenos RNAs (sRNA-seq) seguido de validação por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR).

• População do Estudo: Amostras de tecido placentário foram coletadas de 31 mães infectadas por T. cruzi no Hospital De La Mujer Dr. Percy Boland, em Santa Cruz de la Sierra, Bolívia. As amostras foram classificadas em dois grupos com base nos resultados de qPCR neonatal: 13 de mães transmissoras (recém-nascidos positivos para T. cruzi) e 18 de mães não transmissoras (recém-nascidos negativos).
• Análise de Sequenciamento: O RNA total foi extraído e submetido à preparação de biblioteca de pequenos RNAs e sequenciamento em uma plataforma Illumina NovaSeq 6000 (aproximadamente 20 milhões de leituras por amostra). O processamento de dados envolveu o corte de adaptadores (adapter trimming), mapeamento para o miRBase v22.1 humano usando miRDeep2 e análise de expressão diferencial usando DESeq2. Crucialmente, a análise levou em conta os efeitos de lote de sequenciamento (as amostras foram processadas em dois lotes) e aplicou a correção de taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini-Hochberg.
• Seleção de Candidatos: Dez miRNAs candidatos foram selecionados para validação por meio de uma estratégia hierárquica: significância estatística (valores de p ajustados ou nominais), magnitude da mudança de dobra (fold change) e concordância com a literatura prévia sobre infecção por T. cruzi em modelos placentários.
• Validação por RT-qPCR: Um subconjunto de 15 amostras placentárias (5 transmissoras, 10 não transmissoras) do segundo coorte foi utilizado para RT-qPCR. miRNAs de referência foram selecionados usando o algoritmo geNorm para garantir a normalização estável. A expressão relativa foi calculada pelo método comparativo de Cq com o estimador de Hodges-Lehmann para a mudança de dobra.

Principais Resultados

• Padrões Globais de Expressão: A Análise de Componentes Principais (PCA) revelou que o lote de sequenciamento foi o principal impulsionador da variância global (86,18% antes da correção). Após a correção de lote, o status de transmissão congênita não emergiu como um impulsionador principal do perfil global de miRNA placentário, sugerindo que a transmissão não está associada a um remodelamento amplo do miRNAoma, mas sim a desregulações específicas.
• Expressão Diferencial (sRNA-seq): Na análise combinada, o hsa-miR-155-5p foi o único miRNA significativamente regulado positivamente (upregulated) em placentas transmissoras após a correção de múltiplas testagens (log₂ fold change = 1,26; p-valor ajustado = 0,024). Outros sete miRNAs mostraram significância nominal com log₂ fold changes ≥ 1.
• Validação por RT-qPCR:
  • hsa-miR-155-5p: Embora regulado positivamente no sequenciamento, o RT-qPCR não confirmou significância estatística (log₂ fold change = 0,57; p-valor = 0,426), embora a direcionalidade tenha sido concordante.
  • hsa-miR-193a-5p: Mostrou expressão significativamente maior em mães transmissoras (log₂ fold change = 2,31; p-valor = 0,032).
  • hsa-miR-187-3p: Também mostrou expressão significativamente maior em mães transmissoras (log₂ fold change = 1,53; p-valor = 0,043).
  • hsa-miR-526b-3p: Mostrou uma diminuição significativa em mães transmissoras (log₂ fold change = -0,46; p-valor = 0,043).
  • Concordância: 8 dos 10 miRNAs avaliados mostraram direcionalidade concordante entre o sequenciamento e o RT-qPCR. Três candidatos (hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-187-3p e hsa-miR-526b-3p) atingiram significância estatística na avaliação por RT-qPCR.
• Cluster C19MC: Candidatos do cluster C19MC enriquecido na placenta (incluindo hsa-miR-512-3p e hsa-miR-526b-3p) não mostraram as mudanças significativas observadas em modelos ex vivo anteriores, sugerindo diferenças entre o contexto de infecção experimental aguda e a infecção natural crônica.

Significância e Alegações
Os autores concluem que este estudo identifica candidatos específicos de miRNAs placentários potencialmente relevantes para a transmissão congênita de T. cruzi em mães naturalmente infectadas. Os achados sugerem que a transmissão congênita está associada à desregulação de um subconjunto limitado de miRNAs, em vez de uma interrupção global da expressão de miRNAs placentários.

O artigo apresenta esses resultados de forma modesta, tratando-os como identificação de candidatos em vez de biomarcadores confirmados. Os autores enfatizam que:

1. O estudo fornece insights cruciais in vivo que complementam os modelos existentes ex vivo.
2. Os miRNAs identificados (hsa-miR-155-5p, hsa-miR-193a-5p e hsa-miR-187-3p) merecem investigação adicional para elucidar seus papéis regulatórios na biologia placentária durante a infecção por T. cruzi.
3. Estudos maiores com coortes bem caracterizadas, abordagens transcriptômicas e análises funcionais são necessários para validar esses candidatos e avaliar sua utilidade potencial como biomarcadores para o risco de transmissão congênita.

O estudo reconhece limitações, incluindo o pequeno tamanho da amostra, potenciais efeitos residuais de lote e o fato de o conjunto de RT-qPCR não ser totalmente independente do conjunto de sequenciamento, posicionando o trabalho como um passo exploratório em direção à compreensão da interface molecular da doença de Chagas congênita.