Optimizing in situ eDNA filtration architectures for multitaxon stream biomonitoring in the Neotropics

Resumo Técnico: Otimização de arquiteturas de filtração de eDNA in situ para biomonitoramento de múltiplos táxons em riachos Neotropicais

Definição do Problema
A metabarcoding de DNA ambiental (eDNA) oferece uma ferramenta promissora e não invasiva para o biomonitoramento de águas doces, mas sua confiabilidade em riachos neotropicais permanece limitada pela falta de protocolos de campo adaptados às condições locais. Ambientes tropicais e subtropicais apresentam desafios únicos, incluindo temperaturas elevadas da água que aceleram a degradação do DNA, altas cargas orgânicas que promovem a decomposição enzimática e extremos hidrológicos sazonais que alteram os padrões de transporte e diluição. Além disso, os protocolos existentes, frequentemente desenvolvidos em sistemas temperados, podem não performar de forma otimizada quando aplicados à diversidade de tamanhos de partículas e frações de DNA associadas a comunidades multitaxonicas (peixes, macroinvertebrados, algas, fungos e bactérias). Há uma necessidade crítica de validar arquiteturas de filtração que equilibrem eficiência de captura de DNA, viabilidade operacional e reprodutibilidade, sem assumir que simplesmente aumentar o volume de água filtrada garante uma melhor recuperação da biodiversidade.

Metodologia
O estudo foi conduzido no Riacho Jupirá, um tributário de segunda ordem da bacia do Alto Rio Paraná (sul do Brasil), caracterizado por um clima subtropical úmido e pressões de uso da terra periurbano. Os pesquisadores compararam quatro arquiteturas distintas de filtração in situ projetadas para testar os efeitos do volume de água, tamanho do poro do filtro e composição da amostra:

1. Filtro Único de 600 mL: 600 mL filtrados através de um único filtro de 0,45 µm.
2. Composto 2 × 300 mL: 600 mL de volume total divididos em duas frações de 300 mL, cada uma filtrada através de um filtro de 0,45 µm, com ambos os filtros combinados como uma amostra composta.
3. 1,2 L Apenas Filtro Final: 1.200 mL filtrados sequencialmente através de um pré-filtro de 0,7 µm e um filtro de 0,45 µm, retendo apenas o filtro final de 0,45 µm.
4. Composto de Dois Filtros de 1,2 L: 1.200 mL filtrados sequencialmente através de 0,7 µm e 0,45 µm, com ambos os filtros combinados como uma amostra composta.

Para cada protocolo, foram realizadas quatro réplicas de campo independentes. A água foi filtrada diretamente no riacho utilizando uma bomba peristáltica portátil e filtros de nitrocelulose estéreis de 47 mm. O DNA foi extraído dos filtros e amplificado usando cinco marcadores específicos: NeoFish (12S rRNA) para peixes, FWH (COI) para macroinvertebrados, ITS para algas e fungos, e 16S rRNA V3–V4 para bactérias. O estudo empregou controles de contaminação rigorosos, incluindo brancos de campo, brancos de extração e negativos de PCR. Análises estatísticas (testes de Kruskal–Wallis e comparações pareadas planejadas) avaliaram o desempenho com base na profundidade de sequenciamento, recuperação de Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs), riqueza taxonômica e reprodutibilidade. As detecções de peixes foram validadas cruzadamente contra a amostragem tradicional concomitante de eletropesca e rede de mão.

Principais Resultados

• Arquitetura de Filtração vs. Volume: O estudo descobriu que filtrar volumes maiores (1,2 L) não melhorou linearmente a recuperação da biodiversidade. O protocolo de apenas filtro final de 1,2 L (Protocolo 3) apresentou um desempenho insatisfatório para peixes e macroinvertebrados, gerando significativamente menos contagens de leitura e riqueza de OTUs em comparação aos protocolos compostos. Isso indica que o descarte da fração do pré-filtro (0,7 µm) resulta na perda de um sinal biológico substancial.
• Protocolos Ótimos:
  • Estratégia Multitaxonica Geral: O protocolo composto de dois filtros de 1,2 L (Protocolo 4) proporcionou o desempenho mais equilibrado entre todos os grupos alvo. Ele rendeu a maior média de recuperação de OTUs para peixes, algas, fungos e bactérias, além de alta recuperação para macroinvertebrados, mantendo uma reprodutibilidade aceitável.
  • Específico para Macroinvertebrados: O protocolo composto 2 × 300 mL (Protocolo 2) emergiu como uma alternativa altamente eficaz especificamente para macroinvertebrados, apresentando as contagens de OTUs mais altas e a menor variabilidade entre as réplicas para este grupo.
• Padrões Específicos por Táxon:
  • Peixes: Os protocolos compostos superaram significativamente a abordagem de apenas filtro final, sugerindo que o eDNA de peixes está frequentemente associado a partículas maiores ou muco retido nos pré-filtros.
  • Algas: Embora o protocolo de apenas filtro final tenha gerado as maiores contagens de leitura, o protocolo composto de dois filtros de 1,2 L recuperou a maior riqueza de OTUs, demonstrando que a profundidade de sequenciamento por si só não é um proxy confiável para a amplitude da biodiversidade.
  • Microrganismos (Fungos/Bactérias): Embora baseados em menos réplicas (exploratórios), os dados alinharam-se com a tendência geral, mostrando a maior recuperação de OTUs com o protocolo composto de dois filtros de 1,2 L.
• Validação Cruzada: A amostragem de eDNA detectou todos os quatro táxons de peixes capturados pela eletropesca e redes de mão tradicionais, além de oito táxons adicionais (12 no total contra 4 tradicionais), incluindo espécies de corpo pequeno e bentônicas, frequentemente difíceis de capturar convencionalmente.
• Contaminação: Os controles negativos geraram leituras negligenciáveis e nenhum OTU dos controles permaneceu após a filtragem rigorosa, confirmando a robustez dos procedimentos de descontaminação.

Significância e Alegações
O artigo afirma que, para o biomonitoramento de riachos neotropicais, preservar frações complementares de DNA é mais crítico do que simplesmente aumentar o volume de água filtrada. O estudo fornece um framework prático e operacionalmente validado para a avaliação de múltiplos táxons em ambientes tropicais.

Os autores concluem que o protocolo composto de dois filtros de 1,2 L é a estratégia mais robusta para o monitoramento multitaxônico nesses sistemas, pois maximiza a recuperação da biodiversidade em diversos grupos taxonômicos, garantindo simultaneamente a reprodutibilidade. O protocolo composto 2 × 300 mL é recomendado como uma forte alternativa quando o objetivo primário é a avaliação de macroinvertebrados ou quando restrições logísticas favorecem filtrações de volume moderado e replicadas. Por outro vez, o estudo desaconselha o uso de protocolos de alto volume que descartam as frações de pré-filtro, pois isso leva a uma perda substancial de sinal para táxons-chave.

Em última análise, o trabalho demonstra que a metabarcoding de eDNA pode servir como uma ferramenta complementar, padronizada e menos intensiva em mão de obra para expandir a cobertura da biodiversidade em riachos neotropicais, desde que as arquiteturas de filtração sejam otimizadas para capturar todo o espectro de tamanhos de partículas de DNA presentes no ambiente.