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Ethanol-based, stability-indicating RP-HPLC of the hydrolytically labile prodrug azilsartan medoxomil on a phenyl stationary phase: response-surface development and greenness assessment

Este estudo apresenta o desenvolvimento e a validação de um método RP-HPLC verde e indicativo de estabilidade, utilizando uma fase estacionária de fenila e fase móvel à base de etanol para a quantificação precisa do pró-fármaco hidroliticamente lábil azilsartana medoxomila em comprimidos, otimizado via metodologia de superfície de resposta e avaliado com múltiplas métricas de sustentabilidade (greenness).

Autores originais: Hlib Hikal, Olga Glushachenko, Roman Markin, Oleksandr Syrotychuk

Publicado 2026-09-08

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CC BY 4.0

Autores originais: Hlib Hikal, Olga Glushachenko, Roman Markin, Oleksandr Syrotychuk

Artigo original sob licença CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). ✨ Esta é uma explicação gerada por IA do artigo abaixo. Não foi escrita nem endossada pelos autores. Para precisão técnica, consulte o artigo original. Ler aviso legal completo

A hipertensão arterial é uma força silenciosa que sobrecarrega o coração e os vasos e, para milhões de pessoas, o seu controle depende de uma classe de medicamentos conhecidos como sartanos. Esses fármacos atuam bloqueando um receptor específico no corpo que contrai os vasos sanguíneos, permitindo que eles relaxem. Um dos membros mais eficazes desta família é uma molécula chamada azilsartana medoxomila. Ela é concebida como um "pró-fármaco", o que significa que é uma versão ligeiramente modificada do fármaco ativo que o corpo deve converter após ser ingerido. Esta modificação é uma ligação química delicada, um éster, que torna o medicamento solúvel e pronto para a absorção. No entanto, esta ligação é frágil; se a molécula encontrar água ou certos produtos químicos precocemente, ela rompe-se antes de poder cumprir o seu papel. Esta fragilidade cria um desafio significativo para os cientistas, que precisam de testar o medicamento para garantir que é puro e potente. Eles precisam de uma forma de medir o fármaco intacto sem o quebrar acidentalmente durante o próprio teste, tudo isto enquanto tentam evitar o uso de produtos químicos tóxicos que prejudicam o meio ambiente.

Num estudo recente, investigadores procuraram resolver este duplo problema: como medir este fármaco frágil com precisão, tornando o processo de teste mais seguro para o planeta. A equipa, a trabalhar em instituições na Ucrânia, focou-se em substituir os solventes padrão e perigosos usados na cromatografia líquida — uma técnica que separa substâncias químicas como um crivo a separar areia de cascalho — por uma alternativa mais ecológica. Em vez de utilizarem acetonitrilo ou metanol, que são derivados do petróleo e acarretam riscos para a saúde, recorreram ao etanol, o álcool encontrado nas bebidas, que é renovável e muito menos tóxico. O desafio era que o etanol se comporta de forma diferente num ambiente de laboratório; é mais espesso e move-se mais lentamente através da coluna de teste, o que pode dificultar a separação das substâncias químicas. Além disso, como o fármaco que estão a testar é tão sensível à água, os investigadores tiveram de garantir que o etanol utilizado não continha humidade suficiente para desencadear a degradação do fármaco durante a análise.

Para enfrentar estas questões, os cientistas desenvolveram um novo método de teste utilizando uma coluna especializada revestida com um material fenil, uma superfície que interage de forma diferente com a estrutura química única do fármaco do que as colunas padrão baseadas em carbono. Eles trataram a instabilidade do fármaco não como um inconveniente menor, mas como a regra primária para o desenho do experimento. Ao manter as soluções das amostras e a máquina de teste frias, conseguiram abrandar a reação química que decompõe o fármaco. Também ajustaram cuidadosamente a acidez do líquido que percorre a coluna e a quantidade de etanol misturado, utilizando uma abordagem de modelagem matemática para encontrar o equilíbrio perfeito onde o fármaco permanece intacto, mas se separa limpa de seus produtos de degradação. Este processo permitiu-lhes mapear exatamente como o fármaco se comporta sob diferentes condições, garantindo que o teste mede o medicamento tal como ele existe na pílula, e não como uma versão degradada formada durante o teste.

Os resultados mostraram que esta nova abordagem funciona excepcionalmente bem. A equipa conseguiu separar com sucesso o fármaco intacto do seu produto de hidrólise e de outras potenciais impurezas com alta precisidade. Quando testaram o método em comprimidos comerciais, os resultados coincidiram perfeitamente com as declarações do rótulo, provando que a técnica é fiável para o controlo de qualidade rotineiro. Crucialmente, o estudo confirmou que, ao manter as amostras a uma temperatura fresca de cinco graus Celsius e utilizar etanol puro, seria possível evitar que o fármaco se degradasse significativamente durante as horas necessárias para realizar o teste. Isto significa que o método mede a quantidade real de medicamento no frasco, em vez de uma mistura de medicamento e as suas partes decompostas.

Para além do sucesso técnico, os investigadores avaliaram o quão "verde" o seu novo método é verdadeiramente. Utilizaram quatro sistemas de pontuação diferentes para medir o impacto ambiental, analisando tudo, desde a toxicidade dos produtos químicos até à energia utilizada e aos resíduos gerados. O novo método obteve uma pontuação muito elevada, alcançando uma classificação de 88 de 100 numa das escalas, o que indica um excelente perfil ambiental. As principais razões para esta pontuação elevada foram a substituição de solventes tóxicos por etanol e o uso de um tampão volátil que não deixa resíduos perigosos. Os únicos custos ambientais restantes advieram do volume de líquido utilizado e do facto de o teste ser realizado num único fármaco de cada vez, em vez de múltiplos fármacos simultaneamente. No entanto, comparado com os métodos tradicionais que dependem de produtos químicos perigosos, esta nova abordagem representa um passo significativo em frente. Demonstra que é possível manter os rigorosos padrões exigidos pela segurança farmacêutica, reduzindo drasticamente o dano ao meio ambiente e os riscos para a saúde dos cientistas que realizam os testes.

Resumo Técnico: RP-HPLC de Azilsartana Medoxomila Baseada em Etanol e Indicadora de Estabilidade

Definição do Problema
A azilsartana medoxomila (AZM) é um pró-fármaco éster hidroliticamente lábil utilizado como bloqueador dos receptos de angiotensina II. Sua determinação quantitativa apresenta um desafio duplo: o método analítico deve resolver o éster intacto de seu principal produto de hidrólise, a azilsartana, enquanto simultaneamente previne a hidrólise em solução e na coluna durante a sequência analítica. Os métodos convencionais de HPLC de fase reversa para AZM normalmente dependem de acetonitrila ou metanol combinados com tampões de fosfato não voláteis. Esses sistemas impõem preocupações significativas de ordem ambiental e de segurança devido à toxicidade e à origem petroquímica dos solventes, bem como problemas operacionais relativos à precipitação de tampão em altas concentrações orgânicas. Além disso, metodologias anteriores frequentemente falham em controlar ou quantificar explicitamente a hidrólise do pró-fármaco durante a preparação da amostra, o que pode levar a resultados de ensaio imprecisos que medem produtos de degradação em vez do fármaco intacto.

Metodologia
O estudo desenvolveu um método RP-HPLC indicativo de estabilidade, ecologicamente correto, utilizando uma fase estacionária fenil e uma fase móvel baseada em etanol. O desenvolvimento seguiu uma abordagem de Qualidade por Design (QbD) utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta (RSM).

Condições Cromatográficas: O método utiliza uma coluna XBridge Phenyl (250 × 4,6 mm, 5 µm) com uma fase móvel composta por acetato de amônio 0,02 mol/L (pH 3,5) e 96% de etanol (35:65 v/v). A temperatura da coluna foi mantida em 25°C e a temperatura do amostrador automático foi ajustada para 5°C. A detecção foi realizada a 250 nm.
Desenho Experimental: Foi utilizado um desenho fatorial 3 × 4 para modelar a resolução entre AZM e azilsartana em função do pH da fase móvel (2,0, 4,0, 7,0) e da concentração de etanol (50–80%). O pKa cromatográfico aparente foi determinado como 4,73 para racionalizar o pH de trabalho.
Estratégia de Manuseio de Amostras: Para abordar a instabilidade hidrolítica da AZM, o estudo quantificou explicitamente a degradação em vários diluentes. Determinou-se que, embora o etanol puro oferecesse melhor estabilidade do que misturas aquosas, a degradação ainda ocorria em temperaturas ambientes. Consequentemente, um regime de manuseio de baixa temperatura (5°C) foi implementado tanto para a preparação da amostra (utilizando etanol pré-resfriado) quanto para o amostrador automático, a fim de suprimir a hidrólise ao longo de toda a sequência analítica.
Validação: O método foi validado de acordo com as diretrizes ICH Q2(R2), avaliando especificidade, linearidade, exatidão, precisão e limites de detecção/quantificação. Estudos de degradação forçada foram conduzidos sob condições de estresse ácido, básico, oxidativo, térmico e fotolítico.
Avaliação de Greenness (Química Verde): O perfil ambiental foi avaliado utilizando quatro métricas: Analytical Eco-Scale, índice AGREE, MoGAPI e CaFRI.

Principais Resultados

Desempenho Cromatográfico: A fase estacionária fenil proporcionou retenção e eficiência superiores em comparação com fases C18, atribuídas a interações $\pi$ – $\pi$ suplementares com o arcabouço bifenila do analito. As condições otimizadas (pH 3,5, 65% de etanol) produziram uma resolução prevista ( $R_s$ ) de 13,54, com um valor experimental de 11,70, bem acima do mínimo exigido. Os critérios de adequabilidade do sistema foram atendidos, com uma resolução de 2,01 entre o fármaco parental e o produto de degradação mais próximo.
Estabilidade e Especificidade: O método resolveu com sucesso a AZM de 12 produtos de degradação distintos gerados sob estresse forçado. A análise de pureza de pico confirmou a pureza espectral do pico principal. Crucialmente, o regime de baixa temperatura (5°C) limitou a degradação na solução da amostra a aproximadamente 2% ao longo de 6 horas, garantindo que o ensaio medisse o éster intacto.
Métricas de Validação: O método demonstrou linearidade na faixa de 0,646–0,969 mg/mL ( $r^2 = 0,998$ ). A exatidão (recuperação) variou de 98,32% a 101,04% com uma média de 100,00%. A precisão (RSD) ficou dentro de 0,77% para repetibilidade e 0,44% para precisão intermediária. O Limite de Detecção (LOD) e o Limite de Quantificação (LOQ) foram 0,065 mg/mL e 0,198 mg/mL, respectivamente.
Aplicação: Quando aplicado a comprimidos comerciais de Edarbi® (40 mg), o método resultou em um ensaio médio de 100,6% do valor declarado no rótulo.
Pontuações de Greenness: O método alcançou uma pontuação de Analytical Eco-Scale de 88, um índice MoGAPI de 77, uma pontuação CaFRI de 77 e um índice AGREE de 0,56. As penalidades residuais foram atribuídas principalmente ao rendimento de solvente e ao formato de analito único, em vez de perigos de reagentes.

Significância e Alegações
Os autores alegam que este estudo fornece uma alternativa confiável e ambientalmente responsável aos métodos convencionais de acetonitrila/fosfato para o controle de qualidade de rotina e avaliação de estabilidade da azilsartana medoxomila. A significância do trabalho reside em três áreas principais:

Implementação de Química Verde: Demonstra a integração bem-sucedida de um modificador orgânico de origem biológica (etanol) e um tampão volátil, compatível com MS, em um método de HPLC robusto, reduzindo significativamente os encargos ambientais e de saúde associados aos solventes tradicionais.
Otimização Mecanística: Utiliza uma fase estacionária fenil e RSM para otimizar a seletividade com base nas características estruturais específicas do analito, em vez de depender de colunas C18 padrão.
Controle Explícito de Estabilidade: O estudo aborda uma lacuna crítica na literatura anterior ao quantificar e suprimir explicitamente a degradação hidrolítica do pró-fármaco durante a preparação da amostra. Ao tratar a labilidade hidrolítica como uma restrição de projeto primária, em vez de uma complicação incidental, o método garante a quantificação precisa do éster intacto, o que é essencial para ensaios indicativos de estabilidade.

O artigo conclui que a abordagem proposta é uma alternativa "mais verde" e viável para a análise farmacêutica, equilibrando o desempenho cromatográfico com os objetivos de sustentabilidade sem comprometer a robustez ou a exatidão do método.

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